麻疹病毒屬病毒反向遺傳研究概況

封家旺，李封賽；顧慶云，文 敏，楊康林，達(dá)娃卓瑪，侯紹華，金紅巖，

（1.西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，西藏拉薩850030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京110193；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

麻疹病毒屬隸屬于副黏病毒科副黏病毒亞科，共6個病毒成員，包括犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）、麻疹病毒（Morbillivirus）、海豹瘟病 毒（Phocine distemper virus，PDV）、牛 瘟 病 毒（Rinderpest virus，RPV）、鯨類動物麻疹病毒（Cetacean morbillivirus，CeMV）和小反芻獸疫病毒（Peste－des－petits－ruminants virus，PPRV），核酸序列為不分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA，基因長度為16kb左右，基因組含有6個基因，從3′端到5′端依次為N－P－MF－H－L，依次編碼核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，N）、磷蛋白（phosphoprotein，P）、基質(zhì)膜蛋白（matrix protein，M）、融合蛋白（fusion protein，F(xiàn)）、血凝蛋白（hemagglutinin，H）和大蛋白（large virus－specified RNA polymerase protein，L），以及非結(jié)構(gòu)蛋白V 和C。麻疹病毒對人和動物危害極大，目前牛瘟病毒已被成功凈化，其他病毒的凈化工作還有待進一步加強，解決這一難題均可通過構(gòu)建麻疹病毒屬病毒全長感染性克隆來實現(xiàn)。

1 反向遺傳操作系統(tǒng)

文獻(xiàn)資料顯示，目前應(yīng)用于不分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳系統(tǒng)主要有T7 RNA 聚合酶和RNA 聚合酶Ⅱ反向遺傳操作系統(tǒng)［1］。

1.1 基于T7RNA 聚合酶的反向遺傳操作系統(tǒng)

T7RNA 聚合酶（T7RNA polymerase）是一種由T7噬菌體編碼RNA 聚合酶，長度為883個氨基酸，分子質(zhì)量約99ku，專門催化5′→3′方向的RNA 合成過程。啟動子T7RNA 聚合酶專一性強，即只會轉(zhuǎn)錄T7 啟動子下游的DNA。轉(zhuǎn)錄一旦開始，聚合酶就會沿著模板方向不斷向前移動合成RNA，直至遇到終止子（terminator）序列為止，不再向新合成的RNA 鏈繼續(xù)添加核苷酸，從而新合成的RNA 鏈便從DNA 模板解離［2］?；赥7RNA酶其轉(zhuǎn)錄具有嚴(yán)格的合成高效性和轉(zhuǎn)錄特異性的優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于麻疹病毒屬病毒的全長cDNA 轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建［3］。T7RNA 聚合酶細(xì)胞系的應(yīng)用極大地提高了病毒的拯救效率，借助此細(xì)胞系轉(zhuǎn)染含病毒基因組cDNA 克隆和輔助表達(dá)質(zhì)粒就可以實現(xiàn)病毒的拯救［4］。將含有T7RNA 聚合酶的真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK－21 細(xì)胞，通過使用新霉素加壓篩選，獲得一株穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA 聚合酶的細(xì)胞BSR T7／5，該細(xì)胞系已被廣泛應(yīng)用［5］。也有學(xué)者將T7 RNA 聚合酶表達(dá)在豬腎細(xì)胞，完成了豬瘟病毒的拯救。

1.2 基于RNA 聚合酶Ⅱ的反向遺傳操作系統(tǒng)

T7RNA 聚合酶系統(tǒng)需要預(yù)先感染攜帶T7 RNA 聚合酶的重組痘病毒或轉(zhuǎn)染能表達(dá)T7RNA聚合酶的特定細(xì)胞系，操作過程相對繁瑣，且易造成外源病毒污染。為解決上述難題，國內(nèi)外學(xué)者不斷嘗試建立一種僅借助于細(xì)胞內(nèi)RNA 聚合酶的拯救系統(tǒng)。RNA 聚合酶Ⅱ位于細(xì)胞核的核質(zhì)內(nèi)，蛋白分子質(zhì)量為550ku，由12個亞基組成，負(fù)責(zé)合成mRNA 的前體。目前已成為應(yīng)用較多的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)之一，商品化的真核轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建多該轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。最常見的RNA 聚合酶Ⅱ啟動子為猿病毒40 啟動子和人的巨細(xì)胞病毒啟動子。RNA 聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于3′末端被切斷，經(jīng)腺苷酸化后合成RNA，無明顯的RNA 轉(zhuǎn)錄終止信號［6］。眾多學(xué)者用含人、犬、棉鼠和羊等SLAM 受體的真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf9、CHO、Vero、MDCK、CRFK、BHK－21 和CV1等細(xì)胞，通過加壓篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)SLAM 的細(xì)胞系，該細(xì)胞系在分離病毒和反向遺傳等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用［7－8］。

2 牛瘟病毒的感染性克隆

牛瘟雖已被消滅，但牛瘟病毒感染性克隆的研究在很大程度上推動了其他病毒的相關(guān)研究，為其他病毒的凈化創(chuàng)造條件。Baron M D 等［9］克隆出具有精確末端的牛瘟病毒的全基因組序列，并通過可表達(dá)T7RNA 聚合酶的重組痘病毒，成功拯救RBOK 疫 苗 株。Das S C 等［10］通 過 制 備 嵌 合 的RPV（即PPRV 的H 或F基因取代RPV H 或F基因），結(jié)果表明，當(dāng)僅取代1個基因無法成功拯救病毒，同時取代2個基因，才能夠成功拯救嵌合病毒，說明F和H 基因同時存在方可成功拯救牛瘟病毒。Parida S等［11］成功拯救出一種嵌合牛瘟病毒系統(tǒng)，結(jié)果顯示，該嵌合體病毒在細(xì)胞培養(yǎng)維持高效率的復(fù)制，使用該嵌合疫苗接種的牛無不良反應(yīng)。Banyard A C 等［12］于2010年成功拯救在RPV 全基因組的P基因下游和M 基因上游之間具有獨立轉(zhuǎn)錄單元的EGFP基因的RPV，使用共聚焦顯微鏡即可完成RPV 復(fù)制的檢測。

3 犬瘟熱病毒的感染性克隆

目 前 已 成 功 構(gòu) 建 Onderstepoort、A75／17、5804P、OS 和neurovirulent Snyder Hill等病毒株的 感 染 性 克 ?。?3］。Gassen U 等［14］利 用T7 RNA聚合酶系統(tǒng)成功拯救CDV Onderstepoort疫苗株，采用點突變技術(shù)于L 基因的編碼區(qū)突變2個堿基，實現(xiàn)拯救病毒和親本病毒的區(qū)分。Plattet P 等［15］也構(gòu)建出CDV A75／17株的感染性克隆，并將GFP成功插入CDV 基因組，拯救出能夠表達(dá)GFP 的重組病毒。von Messling V 等［16］在研究中對重組病毒的細(xì)胞嗜性、融合特性和生長特性與親本毒株比較后發(fā)現(xiàn)，影響CDV 細(xì)胞嗜性和細(xì)胞致病性的主要決定因子不是病毒骨架。也有學(xué)者以馴化致弱后的犬瘟熱病毒小熊貓株作為模板，成功拯救出CDV小熊貓株。近年來，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量CDV致病機理領(lǐng)域的研究工作，Ludlow M 等［17］在構(gòu)建CDV SH 株感染性克隆的基礎(chǔ)上，采用反向遺傳學(xué)技術(shù)將EGFP或者紅色熒光蛋白插入到CDV 基因組中，用拯救的病毒感染雪貂，通過檢測報告基因的表達(dá)，表明CDV 感染動物以后能迅速突破血腦屏障進入腦脊液，并擴散到蛛網(wǎng)膜下腔，引起動物發(fā)生急性病毒性腦膜炎，進一步促進了患病動物體內(nèi)病毒的傳播路徑的敏感性病理評估，成功構(gòu)建出研究CDV 傳播機理和急性病毒性腦膜炎發(fā)病機理的新型模型。也有研究將序列比對，在CDV 基因組M和F基因之間存在的非翻譯區(qū)（UTR）具有較高的變異性，利用反向遺傳技術(shù)將CDV 不同毒株之間的M～F區(qū)段進行相互交換，發(fā)現(xiàn)這種改變并不影響病毒的毒力或者表型，證明該區(qū)段在功能上可以互換。Rouxel R N 等［18］將CDV 的M、F、H 與MV的反向遺傳載體構(gòu)建嵌合疫苗，由此產(chǎn)生的病毒沒有引起雪貂疾病或免疫抑制，并具有一定的免疫保護作用。

4 小反芻獸疫病毒的感染性克隆

小反芻獸疫病毒主要感染小反芻動物，表現(xiàn)為發(fā)熱、口炎、腹瀉和肺炎，在世界范圍內(nèi)廣泛流行。國外學(xué)者成功克隆PPRV 的全基因序列，利用精確的3′和5′末端構(gòu)建出的Tu／00株P(guān)PRV 的微型基因組，并針對感染性克隆的啟動子開展研究，結(jié)果表明，有效的微型基因組須包括順式元件、反基因組的啟動子和3個輔助性質(zhì)粒（即N、P 和L）。將全長分4段進行擴增，將基因內(nèi)部酶切位點進行連接，并將報告基因eGFP 插入P 基因與M 基因之間［19］。國內(nèi)有學(xué)者將外源表位與N 蛋白的羧基端融合，替代原始的N 蛋白的輔助質(zhì)粒，結(jié)果證明外源表位幾乎不影響病毒的拯救，表明融合外源表位后對N 蛋白的功能影響較?。?0］。在此基礎(chǔ)之上，Yin C 等［21］利用已構(gòu)建的PPRV／N75／1 株反向遺傳操作系統(tǒng)，構(gòu)建了表達(dá)亞洲1型FMDV－VP1蛋白的重組病毒，接種山羊和牛均可誘導(dǎo)產(chǎn)生PPRV 和FMDV中和抗體，結(jié)果表明，針對亞洲1型FMDV 強毒的攻擊的具有免疫保護作用，說明PPRV／N75／1株作為活載體疫苗具備技術(shù)可行性。Yunus M 等［22］從病毒感染細(xì)胞中提取和純化的核糖核蛋白復(fù)合物、N 蛋白包裹的RNA 模板和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的重組聚合酶復(fù)合物，并將這些成分組合在一起建立PPRV 的體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在體外持續(xù)轉(zhuǎn)錄所有蛋白的mRNA，表現(xiàn)出梯度轉(zhuǎn)錄特性。Muniraju M 等［23］利用體外轉(zhuǎn)錄的方法成功拯救Morocco／2008。Wang Z等［24］于西藏山羊體內(nèi)首次檢測并分離得到病毒，利用體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)成功拯救了PPRV Tibet／Bharal／2008株。

5 結(jié)語

反向遺傳學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域，對于病毒而言，借助分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)，研究范圍不斷地拓展和延伸。麻疹病毒屬成員的致病機理的研究相對復(fù)雜，反向遺傳操作技術(shù)成為其致病機理研究的輔助工具。麻疹病毒屬病毒的感染性克隆經(jīng)過幾十年的研究已取得一定進展，特別是針對麻疹病毒的致病機理和病毒載體方面的研究更加深入［25］。其中MV 的研究最為深入，研究人員從多個方面采用不同的方法就H 蛋白對病毒增殖的影響開展了研究，并利用重組病毒針對新發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵位點進行了驗證。相對于MV 而言，CDV與PPRV 的研究相對滯后，尤其針對PPRV 的研究還需進一步深入。

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