細胞凋亡在介導非小細胞肺癌耐藥調節(jié)中的作用

陳芳芳 綜述，李曉軍 審校

肺癌是當今世界最常見的惡性腫瘤之一，是癌癥死亡的首要原因，約占所有男性癌癥死亡的24%，女性為20%，女性癌癥死亡率甚至超過了乳腺癌［1］。其中大多數(shù)為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，外科手術是 NSCLC早期及局部浸潤階段(Ⅰ期、Ⅱ期和部分Ⅲ期)的主要治療手段，多模式輔助化療是NSCLC晚期的常規(guī)治療方法，而姑息性化療主要治療NSCLC晚期轉移的患者［2］。由于多數(shù)患者確診時已為晚期，不符合手術指征，因此以鉑類化療藥物為主的化療方法成為晚期NSCLC的一線治療方案［3-4］。

順鉑是目前治療肺癌晚期患者的一線化療藥物，其抗腫瘤效應完全歸因于其產(chǎn)生不可修復的DNA損傷，而產(chǎn)生誘導永久性的增殖抑制或線粒體凋亡途徑。但NSCLC患者易產(chǎn)生耐藥，化療藥物的細胞毒作用主要是通過腫瘤細胞DNA的損傷誘導細胞凋亡，因此凋亡途徑的異常與化療耐藥密切相關。

細胞凋亡是細胞在各種死亡信號刺激后發(fā)生的一系列級聯(lián)激活的細胞主動死亡過程。研究表明，腫瘤化療過程中，藥物誘導腫瘤細胞凋亡依賴于正常的細胞凋亡途徑，如果腫瘤細胞的凋亡途徑出現(xiàn)缺陷或抗凋亡作用增強，則可能表現(xiàn)出對藥物的耐藥性。本文主要對細胞凋亡在介導NSCLC耐藥調節(jié)中的作用機制綜述如下。

1 NSCLC分子靶向治療

最近，對于NSCLC 治療的重大進展是對已激活的表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶結構域突變的識別［5］。研究發(fā)現(xiàn)，來自美國和歐洲的NSCLC患者10%的樣本中，這些突變與增強型EGFR酪氨酸激酶抑制劑厄洛替尼和吉非替尼［6］存在一定關聯(lián)。同時還發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變往往伴隨基因擴增［7］。EGFR基因突變可導致獨立配體刺激的信號轉導，中繼信號通過PI3K-AKT-mTOR信號通路參與細胞存活，或通過RAS-RAF-MEK-ERK信號通路參與細胞增殖［8］。有研究證實，酪氨酸激酶抑制通過EGFR的突變可導致細胞的凋亡，細胞是通過突變蛋白誘發(fā)凋亡的［9］。這就說明EGFR酪氨酸激酶抑制劑在提高EGFR突變的NSCLC患者生存率方面發(fā)揮重要作用［10-11］。

NSCLC分子譜揭示還存在其他一些突變，如EML4-ALK的易位［12］。在臨床前研究和臨床研究中，ALK激酶抑制劑有很高的臨床靈敏度［13-14］。已發(fā)現(xiàn)在肺腺癌中體細胞基因會發(fā)生改變，主要包括BRAF［15］、Her2［16］和 PIKC3A［17］基 因 的 突 變。在NSCLC靶向治療進展中不斷有新的分子靶標被發(fā)現(xiàn)，但均不能成為NSCLC靶向治療的根治方法［18］，上述的分子靶標只能應用于部分患者的治療，而多數(shù)患者仍依賴于聯(lián)合鉑類為基礎的標準化療方案。除了腫瘤分子標記物，生物標記物亦可能對NSCLC的治療及預后起到關鍵作用，因此對NSCLC相關的生物標記物的研究成為熱點。最近，血漿纖維蛋白原與NSCLC間的關系引起廣泛關注。在肺癌早期經(jīng)手術切除后，血漿纖維蛋白原的升高預示著手術存在切除不完全的風險［19］。研究已證實，血清纖維蛋白原是癌癥復發(fā)和癌癥生存率的一個獨立預測因子［20-21］。纖維蛋白原作為腫瘤生物標記物的機制尚不清楚，但作為一種細胞外基質，它在促進血管生成等方面的作用已得到證實［22-25］。

2 細胞凋亡

凋亡是一種基因編碼的細胞程序性死亡，其基本形態(tài)特征為:核固縮、核及細胞碎片、胞膜空泡化及炎癥壞死細胞的吞噬［26］。細胞凋亡廣泛存在于從蠕蟲到人類多細胞生物體內，并對正常發(fā)育和體內平衡起到關鍵作用。凋亡表型是通過激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶而產(chǎn)生，半胱氨酸蛋白酶家族被稱為半胱天冬酶，其分層級聯(lián)激活會導致細胞凋亡。

半胱天冬酶分為兩類，即觸發(fā)半胱天冬酶和效應半胱天冬酶。caspase-8、9和10屬于觸發(fā)半胱天冬酶，在凋亡信號早期激活且限制裂解目標，并能有效地限制自身裂解。與之相反，caspase-3、6和7屬于效應半胱氨酸蛋白酶，有著上百個切割位點廣泛分布于整個細胞［27］，且以無活性二聚體的形式分布在胞質溶膠中。由觸發(fā)半胱氨酸蛋白酶引起的激活效應，主要是通過在大、小亞基間的連接區(qū)域斷裂活動轉化為具有催化活性的酶，使得分子內重排以形成酶的活性二聚體［28］。caspase-8、10參與死亡受體信號通路，caspase-9則參與線粒體凋亡途徑。caspase-3、7顯示高度相似的底物特異性，在小鼠成纖維細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，主要因為其缺乏抵抗內、外凋亡刺激的影響［29］。

半胱天冬酶激活是啟動凋亡的關鍵步驟。細胞膜死亡受體(caspase-8)的激活以及線粒體功能障礙(caspase-9)均能激活半胱天冬酶，從而引起細胞凋亡，凋亡過程是通過死亡受體凋亡途徑和線粒體凋亡通路來調控的。細胞凋亡通路由多種調節(jié)及執(zhí)行元件組成的復雜且精細的網(wǎng)絡系統(tǒng)，任何凋亡相關蛋白的異常表達或功能缺陷均可能引起細胞凋亡抵抗從而導致化療失敗，其中促凋亡因子和抑制凋亡因子的平衡在凋亡發(fā)生過程中起著極其重要的作用。

2.1 外源性凋亡途徑 外源性凋亡途徑是通過表達在哺乳動物細胞表面的死亡受體信號傳導發(fā)生的。腫瘤壞死因子(TNF)主要通過細胞表面受體結合及活化引起細胞發(fā)生凋亡，尤其是腫瘤細胞的凋亡。目前已被確認，人體內含有至少18個TNF家族的配體和29個受體［30］。TNF超家族成員通過腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)及其靶向受體，致多種腫瘤細胞發(fā)生凋亡，而對正常細胞無影響。TRAIL不僅通過結合特定的跨膜受體TRAILR1(DR4)和 TRAIL-R2(DR5)［31-32］，還可通過非功能受體 TRAIL-R3 和 TRAIL-R4(DcR1和 DcR2)［32］激活細胞凋亡途徑。TRAIL與死亡受體(DR4和DR5)結合，會導致受體三聚體以及死亡誘導信號復合物(DISC)的形成，這為后續(xù)引發(fā)的caspase的激活起到關鍵性作用。

2.2 內源性凋亡途徑 另一個主要的細胞凋亡途徑是導致半胱天冬酶激活和細胞死亡的內源性(線粒體)凋亡途徑。死亡誘導信號復合物(DISC)的形成是外源性凋亡途徑的關鍵步驟，而線粒體外膜透化作用(MOMP)是細胞凋亡蛋白酶活化以及線粒體凋亡途徑的關鍵因素。顧名思義，這種細胞凋亡途徑主要是由于細胞內部壓力如DNA損傷、內質網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)應激所致［27］。

在細胞凋亡過程中，MOMP主要由BCL2蛋白質家族控制［33］。促細胞凋亡成員包括:BAX［34］、BAK［35］和BH1-3結構域。BAX和BAK為激活線粒體外膜上MOMP的主要效應蛋白［36］。DNA損傷、生長因子缺乏會導致BCL2蛋白家族抗凋亡和促凋亡平衡的轉變?！岸嘟Y構域的”促凋亡成員，如BAX或BAK，是細胞死亡致線粒體功能障礙所需的重要通道［36］。在收到死亡信號后，BAX易位到BAK已經(jīng)存在的線粒體表面［37-38］。已明確，BAX和(或)BAK的活化是導致MOMP的前提條件，但具體機制尚不清楚。MOMP關鍵特性是半胱天冬酶的激活以及細胞色素C的釋放。已有研究表明，由于細胞缺乏細胞色素C，因此未能激活對紫外線輻照、血清或星形孢菌素做出應答的半胱天冬酶［39］。細胞色素C是電子傳遞鏈的重要組成部分，其主要功能是氧化磷酸化。在MOMP作用過程中釋放的其他重要的線粒體膜間隙蛋白質是第二線粒體源細胞凋亡蛋白酶激活物(SMAC)，也稱低等電點的直接IAP結合蛋白(DIABLO)，它結合XIAP，抵消其抑制細胞凋亡蛋白酶的能力［40-41］。

3 順鉑與細胞凋亡

順鉑(順式-順鉑Ⅱ)是治療NSCLC最有效的以鉑類為基礎的一線化療藥物［42］。順鉑形成鉑類共價復合物抑制DNA的復制、RNA的轉錄以及蛋白的表達，從而引起DNA的損傷，致細胞周期紊亂并導致細胞凋亡的活化［43］。順鉑主要通過誘發(fā)凋亡引起細胞死亡，同時凋亡信號缺陷也會產(chǎn)生順鉑耐藥性。凋亡主要有兩種途徑:配體結合TNF-α受體超家族及procaspase-8通過適配器形成死亡誘導信號復合物(DISC)從而啟動外源性凋亡途徑;內源性凋亡途徑是由細胞應激引發(fā)，如DNA損傷，導致細胞色素C從線粒體中釋放，通過相互作用與細胞凋亡活化因子-1(APAF-1)引起procaspase-9的活化并形成凋亡復合體。Bcl-2家族蛋白是通過釋放線粒體內細胞色素C來調節(jié)DNA損傷引起的細胞凋亡。

細胞凋亡可以作為癌癥發(fā)生發(fā)展的一個天然屏障［44］。通常情況下，細胞周期紊亂引起的基因突變和腫瘤的發(fā)生發(fā)展會觸發(fā)細胞發(fā)生凋亡［45］。因此，癌癥的一個重要特征即癌細胞逃避凋亡的能力［46］，癌細胞失去細胞凋亡的能力，就會促進腫瘤的發(fā)生，同時還會引起癌細胞產(chǎn)生耐藥性［47］。NSCLC細胞對多種細胞毒治療產(chǎn)生抗性提示癌細胞存在凋亡信號的缺陷，進一步了解癌細胞抗細胞凋亡的機制對于更合理的使用抗癌藥物的治療至關重要。

4 凋亡阻斷與腫瘤細胞耐藥

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，癌細胞逐漸獲得了抵抗凋亡的能力，從而導致腫瘤細胞耐藥的產(chǎn)生。線粒體凋亡阻斷大致分為三類［48］:A類阻斷發(fā)生在當異常行為抑制促凋亡激活物產(chǎn)生時，異常行為包括基因組不穩(wěn)定、致癌基因的激活、BH3-only蛋白產(chǎn)生的死亡信號通路等;B類阻斷發(fā)生在BCL2家族(BAX和BAK)的感受器有重大損傷時;C類阻斷發(fā)生在當抗凋亡BCL2家族蛋白的高表達抑制或阻斷了促凋亡蛋白BH3-only的表達。在這種情況下，細胞會產(chǎn)生一定的BH3-only死亡信號，然而卻被抗凋亡分子所抑制。細胞在這種狀態(tài)時被稱為“準備死亡”，或者是對過表達的抗凋亡蛋白“上癮”。凋亡阻斷可為不同的化療藥物對癌細胞有著不同敏感性以及多藥耐藥現(xiàn)象的產(chǎn)生作出解釋［33］。C類阻斷多出現(xiàn)于腫瘤細胞中，有助于解釋為什么化療法通常對癌癥治療更具毒性［33］。促凋亡蛋白 BAX和BAK的缺失會觸發(fā)B類凋亡阻斷，有研究［49］表明，BAX或BAK可作為NSCLC的預后標志物，而且化療藥物敏感性會隨著BAX表達量的增加而增高。

BH3分析法是一種新興技術，主要用于區(qū)分腫瘤過程中凋亡阻斷類型［48］，其技術方法涉及線粒體從腫瘤細胞的BH3肽段分離，通過評估反應的模式來確定凋亡阻斷的類型。BH3分析法可為選擇一種靶向腫瘤抗凋亡蛋白，提高腫瘤藥物治療提供一定的幫助。

NSCLC中BAX和BAK蛋白的雙重缺失，會導致細胞凋亡耐藥表型的出現(xiàn)，由此對NSCLC的放化療療效及其生存率產(chǎn)生重大影響。線粒體B類凋亡阻斷很可能成為抵抗NSCLC靶向治療因素之一。體外研究證明，由于BAX和BAK蛋白的缺失，線粒體內VDAC產(chǎn)生出己糖激酶導致細胞色素C的釋放，從而介導細胞死亡［50］，AKT的激活以及 Bcl-2家族抗凋亡與促凋亡蛋白表達的平衡是治療癌癥的有效方法。

事實上，幾乎所有的腫瘤細胞都有細胞凋亡的缺陷［51］，任何凋亡相關蛋白的異常表達或功能缺陷均可能引起細胞凋亡抵抗從而導致化療失敗。越來越多的證據(jù)證明細胞凋亡在腫瘤生物學中發(fā)揮著重要作用，因此，了解細胞凋亡的分子機制將有助于我們開發(fā)有效的藥物，通過誘導細胞死亡，從而阻止失控的惡性細胞的擴散。

5 結論

化療耐藥是NSCLC臨床治療失敗的主要原因，也是當前有待解決的世界性難題。目前，以鉑類為基礎的聯(lián)合化療是NSCLC的標準化治療手段，細胞凋亡抑制是肺癌順鉑耐藥的主要原因之一。因此，了解NSCLC中抗細胞凋亡機制，可為NSCLC的臨床新靶點治療提供一定的理論基礎。

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