青壯年軍人腰腿痛患者HLA-B27及其基因亞型檢測(cè)分析

高文博，徐海棟，劉 剛，李衛(wèi)巍，夏欣一，虞 偉，李曉軍

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，主要侵犯骶髂關(guān)節(jié)、中軸骨骼，也可涉及周邊關(guān)節(jié)、眼、腸道和主動(dòng)脈［1］;其在我國的發(fā)病高峰為15～35歲，平均年齡25歲，并且男性平均好發(fā)年齡小于女性。自20世紀(jì)70年代Brewerton等［2］首次提出人類白細(xì)胞抗原B27(HLA-B27)與強(qiáng)直性脊柱炎(AS)之間存在密切關(guān)系后，大量研究數(shù)據(jù)［3］進(jìn)一步證實(shí)，早期 HLAB27檢測(cè)對(duì)AS診斷有重要作用。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，AS患者HLA-B27陽性率高達(dá)90% ～96%，而普通人群HLA-B27陽性率僅4% ～9%。軍人是一類特殊群體，大部分為青壯年，正處于AS好發(fā)年齡段。為此，我們用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)2126例因腰腿痛到南京軍區(qū)南京總醫(yī)院就診的軍人患者進(jìn)行了HLAB27抗原檢測(cè)，同時(shí)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)確診AS患者進(jìn)行HLA-B27基因亞型分析，以探討AS患者HLA-B27抗原陽性及其基因亞型分布及其對(duì)AS的診斷意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2013年8月1日－2014年1月10日，因腰背痛或關(guān)節(jié)痛到南京軍區(qū)南京總醫(yī)院就診的軍人患者2126例，其中男1885例，女241例;年齡15～55(25.8±9.0)歲;明確 AS診斷者36例，男29例，女7例。AS診斷符合1984年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ASA)關(guān)于AS的修訂紐約標(biāo)準(zhǔn)［4］。

1.2 主要儀器與試劑 FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司);ABI7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。HLA-B27試劑盒(美國BD公司;DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司);HLA-B27基因高分辨率分析試劑盒(天津秀鵬公司);Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)。

1.3 HLA-B27檢測(cè) 空腹抽取2126例患者靜脈血5 mL，加入含EDTA-K2抗凝劑的真空采血管中，按試劑盒操作說明書進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣品采集的細(xì)胞數(shù)不少于15 000個(gè)，通過校準(zhǔn)微球設(shè)定熒光界值，以CD3(T淋巴細(xì)胞)設(shè)門并檢測(cè)其HLA-B27的表達(dá)熒光強(qiáng)度，≥本批HLA-B27試劑盒設(shè)定界值141者，報(bào)告為HLA-B27陽性，否則為HLA-B27陰性。

1.4 HLA-B27基因亞型分型

1.4.1 DNA提取 用 QIAGEN公司 DNA提取試劑盒提取PBMC中DNA，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作(DNA濃度為30～100 ng/μL，A值260/280比值1.60 ～2.00)。

1.4.2 HLA-B27亞型分型 用HLA-B27基因高分辨率分型試劑盒，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系20 μL(包括 dNTP-Buffer 18 μL、5 U/μL Taq 酶0.15 μL、熒光染料 0.25 μL 和 DNA 2 μL)，加入含有特定引物的反應(yīng)板的相應(yīng)孔中。擴(kuò)增條件:96℃ 2 min;96 ℃ 20 s，68 ℃ 60 s，5 個(gè)循環(huán);96℃ 20 s，65℃ 50 s，72℃ 45 s，10個(gè)循環(huán);96 ℃ 20 s，63 ℃ 50 s，72℃ 45 s，15個(gè)循環(huán);采集熒光信號(hào)，72℃ 2 min。人生長激素(HGH)基因序列特異性引物為內(nèi)參。溶解曲線按儀器默認(rèn)程序。B27引物孔擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)擴(kuò)增期，且該孔溶解導(dǎo)數(shù)曲線峰值/內(nèi)參孔溶解導(dǎo)數(shù)曲線峰值的比值≤2.5，判斷為陽性，否則判斷為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。組間HLA-B27陽性率的比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HLA-B27檢測(cè)結(jié)果 2126例腰腿痛患者中，HLA-B27陽性者僅為158例，占受檢總數(shù)的7.4%(158/2126)，其中男性134例，占男性患者總數(shù)7.1%(134/1885);女性24例，占女性患者10.0%(24/241)。女性患者HLA-B27陽性率高于男性，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 HLA-B27陽性與AS關(guān)系 在2126例腰腿痛患者中，根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診AS者36例(1.69%，36/2126)。36例AS患者中，HLA-B27陽性33例，占全部腰腿痛患者的1.55%(33/2126)，占 HLAB27 陽性者20.89%(33/158)。

2.3 確診AS患者HLA-B27基因亞型分型 33例HLA-B27陽性者，應(yīng)用HLA-B27基因高分辨率試劑盒檢測(cè)，17例表現(xiàn)為 B*2704，占 51.5%(17/33)，是主要型別;14例表現(xiàn)為 B*2705，占 42.4%(14/33);1例HLA-B27陽性，分型未定，占3.03%(1/33);1例同時(shí)表達(dá)B*2705/B*4002-10合并雜合，占3.03%(1/33)。

3 討論

AS是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，也是脊柱關(guān)節(jié)病的一種。主要累及中軸關(guān)節(jié)和骶髂關(guān)節(jié)，引起腰痛、晨僵、脊柱活動(dòng)受限、外周關(guān)節(jié)受累、肌腱端炎、足跟痛等關(guān)節(jié)癥狀，也可引起較為少見的關(guān)節(jié)外癥狀，如虹膜炎、心血管表現(xiàn)、肺部表現(xiàn)和骨質(zhì)疏松等。AS在世界各地分布廣泛，不同種族和地區(qū)患病率差異較大?？傮w來說，AS患病率白種人較高，黃種人次之，黑種人最低。AS在各年齡段均可發(fā)病，發(fā)病高峰為15～35歲，平均發(fā)病年齡25歲左右。段振華等［5］研究發(fā)現(xiàn)，我國男性平均發(fā)病年齡23.0歲，女性為27.0歲，且性別間差異明顯。以前普遍認(rèn)為AS以男性居多，但近幾年來的研究顯示，男女比例差距主要是由于女性發(fā)病較為隱匿、癥狀較輕易誤診漏診造成的［6］。

目前，AS病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，但普遍認(rèn)為免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)是其主要致病機(jī)制，包括細(xì)胞因子、T細(xì)胞相互作用、遺傳和微生物感染等。臨床上，多數(shù)AS患者均有消化系統(tǒng)及肺部感染病史，亦提示感染可能是AS的誘發(fā)因素［7］。HLA-B27與AS的相關(guān)性是迄今為止已知的HLA與疾病的關(guān)聯(lián)中最強(qiáng)和最典型的［8］。有研究表明，HLA-B27陽性率和等位基因的分布在不同種族和地區(qū)中存在差異，因此分析不同人群中HLA抗原表達(dá)有助于疾病的早期診斷、預(yù)防和預(yù)判。本研究顯示HLA-B27陽性率為7.4%，高于文獻(xiàn)報(bào)道健康人群的陽性率(4.5%)［9］，其原因可能為本研究人群中男性多于女性，且所處年齡位于AS好發(fā)年齡段，但這一數(shù)值卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于朱宇芳［10］(44.8%)、鄒玲莉等［11］(28.30%)等的相關(guān)報(bào)道，估計(jì)與HLA-B27檢測(cè)受到本院醫(yī)生的普遍重視，已成為篩查腰腿疼痛患者特別是部隊(duì)官兵的常規(guī)項(xiàng)目有關(guān)。另外吳振彪等［12］關(guān)于某部隊(duì)官兵脊柱關(guān)節(jié)病的流行病學(xué)調(diào)查也顯示，部隊(duì)官兵的AS患病率(0.21%)反而低于普通人群的患病率(0.4%)［13］，考慮與部隊(duì)人群的特點(diǎn)及近年部隊(duì)生活條件和就醫(yī)情況改善有關(guān)。

國內(nèi)外已有大量關(guān)于HLA-B27亞型分布情況的報(bào)道。不同研究人群，HLA-B27亞型分布情況不同。本研究顯示，B*2704為本項(xiàng)研究AS患者主要型別占 51.5%，其次為 B*2705占 42.4%，與上海［14］、廣東［15］等地研究報(bào)道相符，而韓國［16］和歐洲［17］AS患者B*2705為主要亞型?？紤]到本研究確診AS患者例數(shù)較少，可能存在選擇偏倚，需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。關(guān)于家系分析的研究表明，在HLA-B27陽性的AS患者一級(jí)親屬中，HLA-B27陽性者占31.3%，并且這些親屬患AS的相對(duì)危險(xiǎn)率達(dá)到120.4，是正常家庭對(duì)照組的10.8 倍［18］。本研究中36例確診AS患者中5例有家族史，亦發(fā)現(xiàn)AS在部隊(duì)中有較高的發(fā)病率，部分患者一入伍即查出患有AS，因此如果在入伍查體中進(jìn)行家族史的詢問調(diào)查及相關(guān)專業(yè)檢查，可以有效減少AS在部隊(duì)的患病率，有利于提高部隊(duì)訓(xùn)練水平及戰(zhàn)斗力。但是值得注意的是，大約80%的HLA-B27陽性者并不發(fā)生AS，大約10%的AS患者HLA-B27為陰性，提示HLA-B27在AS患者中表達(dá)可能只是一個(gè)重要的遺傳因素，并不是影響本病的唯一因素。在本研究的2126例腰腿痛軍人患者中只有7.4%HLA-B27為陽性，而確診AS患者僅1.69%。由于HLA-B27檢測(cè)費(fèi)用較高，從醫(yī)療成本考慮是對(duì)醫(yī)療資源的極大浪費(fèi)，因此建議軍人患者就醫(yī)時(shí)，嚴(yán)格區(qū)分訓(xùn)練傷情［19］，并在有家族史或者其他較為明確的臨床指征時(shí)再行HLA-B27檢測(cè)，而不宜將其列為AS的篩選指標(biāo)。

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