甲醛對(duì)小鼠器官組織內(nèi)cAMP含量的影響及其機(jī)理探討

曹鳳華， 李 慧， 張玉超， 劉志敏， 梅宇飛， 尚 帥， 楊 旭， 丁書茂

(華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430079)

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甲醛對(duì)小鼠器官組織內(nèi)cAMP含量的影響及其機(jī)理探討

曹鳳華， 李 慧， 張玉超， 劉志敏， 梅宇飛， 尚 帥， 楊 旭， 丁書茂*

(華中師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430079)

為探討甲醛是否通過信號(hào)分子途徑影響造血系統(tǒng)的代謝調(diào)節(jié)，選用雄性Balb/c小鼠為研究對(duì)象，采用動(dòng)態(tài)吸入方式染毒7 d，每天8 h，染毒濃度分別為0，0.5，1.0，3.0 mg/m3.染毒結(jié)束后，檢測(cè)小鼠腦、血漿、骨髓中cAMP含量變化.結(jié)果表明，在不同濃度的甲醛暴露條件下，與空白對(duì)照組相比，腦組織中cAMP含量沒有顯著性變化；血漿中cAMP含量與對(duì)照組相比，0.5、3.0 mg/m3染毒組出現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01)，1.0 mg/m3染毒組出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)；骨髓中cAMP含量與對(duì)照組相比，0.5，1.0，3.0 mg/m3染毒組都出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05).研究表明，甲醛暴露對(duì)造血系統(tǒng)的毒性與胞內(nèi)信號(hào)分子cAMP傳導(dǎo)途徑相關(guān).

甲醛； 小鼠； cAMP； 機(jī)制

甲醛是一種常見的裝修型室內(nèi)空氣污染物[1-2]，甲醛暴露對(duì)動(dòng)物甚至人類的毒性作用是多種多樣的，不僅對(duì)免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性，還具有遺傳毒性、神經(jīng)毒性和致癌作用[3].2004年，IARC明確指出：甲醛能嚴(yán)重影響人類健康，并確定甲醛是A1組人類致癌物[4].2011年11月，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所確定甲醛暴露可以引發(fā)白血病[5]，但誘導(dǎo)人感染白血病產(chǎn)生的機(jī)制尚不清楚.

甲醛與白血病關(guān)系的研究，關(guān)鍵在于造血系統(tǒng)是否受甲醛暴露影響，其中，骨髓組織是一個(gè)非常重要的靶器官.Heck[6]等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體內(nèi)甲醛濃度一直保持在恒定水平，不隨外界甲醛濃度改變而改變，但有研究表明吸入性甲醛對(duì)血液、骨髓等組織存在一定的毒性[7-8].甲醛也是一種生物內(nèi)源性有機(jī)化合物，甲醛污染所造成的毒性，很可能不是甲醛分子本身具有毒性，而是直接進(jìn)入到組織后，破壞機(jī)體甲醛濃度的平衡，作為信號(hào)分子干擾了造血系統(tǒng)的代謝調(diào)節(jié).

3’，5’-環(huán)磷酸腺苷(cyclicadenosine monophosphate，cAMP)是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)信使，由于參與細(xì)胞內(nèi)多種調(diào)節(jié)機(jī)制，將cAMP稱為第二信使，它是ATP在腺苷酸環(huán)化酶(AC)的作用下生成，在正常細(xì)胞中的含量甚微.許子亮[9]等的研究表明，血中cAMP含量的變化與白血病及再生障礙性貧血癥有相關(guān)性.為研究吸入性甲醛是否以信號(hào)分子的途徑對(duì)造血系統(tǒng)機(jī)制產(chǎn)生影響，選擇小鼠骨髓、血漿、腦為研究材料，檢測(cè)其cAMP含量的變化，以探索甲醛引起白血病的分子機(jī)理.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級(jí)雄性Balb/c小鼠，購于湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心.

1.2 主要試劑和儀器

試劑:10%的甲醛溶液(Sigma公司)；小鼠環(huán)磷酸腺苷ELSA檢測(cè)盒(濟(jì)南朋遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司).

儀器:HOPE-MED 8050動(dòng)式染毒控制系統(tǒng)；4160-2型甲醛測(cè)定儀(Interscan公司)；冷凍離心機(jī)(Eppendof-5415R)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(BIO-TEK，美國(guó))等.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1染毒 將24只Balb/c小鼠隨機(jī)分為1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)染毒組，每組6只，甲醛經(jīng)HOPE-MED 8050動(dòng)式染毒控制系統(tǒng)調(diào)配后，持續(xù)穩(wěn)定地輸出濃度為0.5 mg/m3[10]，1.0 mg/m3，3.0 mg/m3[11]的甲醛氣體，染毒組在染毒艙中連續(xù)動(dòng)態(tài)染毒7 d，每天8 h.在染毒期間，所有小鼠禁止進(jìn)食和飲水.1.3.2小鼠血漿的采集 本實(shí)驗(yàn)采用心臟取血的方法進(jìn)行采血.染毒結(jié)束后，腹腔注射麻醉劑(1%戊巴比妥鈉溶液，生理鹽水配制)使各染毒組小鼠麻醉.每只小鼠的麻醉劑量依小鼠體重而定:0.02 mL/kg.待小鼠徹底麻醉以后，用一次性1 mL注射器抽取950 μL～1 000 μL血液.抽血前每只注射器先抽取少量濃度為15 g/L的EDTA(抗凝劑)來回浸潤(rùn).抽血結(jié)束后立即將得到的血液注入新的裝有少量抗凝劑的EP管中，3 000 r/min離心15 min，取上清，用于cAMP含量的檢測(cè).

1.3.3 小鼠腦組織勻漿的制備 心臟取血后，用頸椎脫臼法處死小鼠，立即取腦組織，根據(jù)小鼠環(huán)磷酸腺苷ELSA檢測(cè)盒說明書，將腦組織在冰冷的生理鹽水中漂洗，用濾紙拭干，腦組織加生理鹽水制成10%勻漿液，低溫離心后取上清，用于cAMP含量的檢測(cè).

1.3.4 小鼠骨髓細(xì)胞的制備 取出雙側(cè)股骨，用1 mL生理鹽水吹出骨髓組織細(xì)胞，4℃，500 g離心5 min，棄上清.配制骨髓組織細(xì)胞懸液，濃度為1×106個(gè)/mL.取細(xì)胞懸液1 mL，加60 μL細(xì)胞裂解液，裂解20 min，混勻5次，再裂解20 min，4℃，12 000 g離心5 min，取上清，用于cAMP含量的檢測(cè).

1.3.5 cAMP含量的測(cè)定 小鼠腦、血漿、骨髓組織中cAMP含量的測(cè)定，嚴(yán)格按照小鼠環(huán)磷酸腺苷ELSA檢測(cè)盒說明書進(jìn)行測(cè)定.測(cè)得結(jié)果后，按要求作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求算樣品中cAMP 含量.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 氣態(tài)甲醛暴露對(duì)小鼠血漿中cAMP含量的影響

不同濃度氣態(tài)甲醛染毒下小鼠血漿中cAMP含量如圖1所示，隨著染毒濃度的升高，cAMP含量先升高后降低，其中，1.0 mg/m3染毒組與對(duì)照組存在顯著差異(P<0.05)，0.5、3.0 mg/m3染毒組與對(duì)照組存在極顯著差異(P<0.01).

2.2 氣態(tài)甲醛暴露對(duì)小鼠骨髓組織中cAMP含量的影響

如圖2所示，不同濃度氣態(tài)甲醛染毒下，小鼠骨髓組織cAMP含量均升高，0.5、1.0、3.0 mg/m3染毒組與對(duì)照組均存在顯著性差異(P<0.05).

(與對(duì)照組相比, *: P< 0.05， **: P< 0.01)

(與對(duì)照組相比， *: P< 0.05)

2.3 氣態(tài)甲醛暴露對(duì)小鼠腦組織中cAMP含量的影響

如圖3所示，不同濃度氣態(tài)甲醛染毒下，小鼠腦組織cAMP含量沒有發(fā)生顯著性變化.

(與對(duì)照組相比,*: P< 0.05)

3 討論

許多文獻(xiàn)表明，cAMP在細(xì)胞代謝及多種生理效應(yīng)的實(shí)現(xiàn)中具有關(guān)鍵的作用，外源cAMP具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)分化的作用，神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞、基因表達(dá)、激素調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)以及細(xì)胞的增殖和分化均與cAMP有關(guān)[12-14]，而且在腫瘤細(xì)胞內(nèi)普遍存在著cAMP下降現(xiàn)象.在白血病致病機(jī)理的研究中，很多研究結(jié)果表明，白血病患者血液中cAMP含量低于正常值[9-15]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明甲醛染毒后，各組織器官中cAMP含量發(fā)生變化，由此可以推斷甲醛對(duì)造血系統(tǒng)的毒性很可能與cAMP信號(hào)分子途徑存在一定聯(lián)系.

3.1 甲醛暴露對(duì)小鼠血漿、骨髓、腦中cAMP含量的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠血漿、骨髓、腦三者的cAMP含量的本底水平存在差異，甲醛染毒后，cAMP含量變化趨勢(shì)也不相同.

小鼠血漿中cAMP含量出現(xiàn)了從高到低的顯著性變化.這種情況的出現(xiàn)值得思考，0.5 mg/m3染毒組顯著性升高的原因與Suat Erdogan[17]等的研究結(jié)果相關(guān)，機(jī)體內(nèi)cAMP含量隨承受剌激強(qiáng)度的增加顯著增多，而cAMP含量升高能夠抵抗炎癥并且保護(hù)組織.在低濃度甲醛暴露時(shí)，小鼠自身的防御系統(tǒng)能夠通過提高cAMP含量從而減少甲醛毒性對(duì)機(jī)體的損傷.3.0 mg/m3染毒組出現(xiàn)顯著性降低是因?yàn)椋?dāng)處于高濃度甲醛暴露環(huán)境中時(shí)，小鼠自身的防御系統(tǒng)因無法繼續(xù)維持而崩潰，最終導(dǎo)致cAMP含量極顯著性降低，組織器官受到損失，嚴(yán)重時(shí)可致癌.

小鼠骨髓中cAMP含量出現(xiàn)顯著性升高.甲醛暴露能夠影響小鼠骨髓細(xì)胞的分裂與分化，對(duì)骨髓細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生毒害作用[7]，而cAMP信號(hào)通路下游的cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)能夠促進(jìn)一些控制骨髓細(xì)胞增殖和分化的基因表達(dá)[18]，所以cAMP含量的升高，可能刺激控制骨髓細(xì)胞增殖和分化的基因表達(dá)，從而減少甲醛暴露引起的骨髓細(xì)胞的損傷，但如果小鼠持續(xù)處于這種甲醛暴露環(huán)境中，這種防御機(jī)制無法維持身體正常運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，機(jī)體則會(huì)趨向于發(fā)生癌變.

有研究表明，腦損傷后會(huì)釋放各種神經(jīng)介質(zhì)、遞質(zhì)和自由基，通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，可導(dǎo)致血腦屏障開放，但提高內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)cAMP含量，能明顯阻止血腦屏障開放[16].本實(shí)驗(yàn)中，小鼠腦中cAMP含量沒有發(fā)生顯著性變化，這說明短時(shí)間的甲醛染毒并沒有造成嚴(yán)重的腦損傷，血腦屏障有效的保護(hù)了腦組織，小鼠自身的血腦屏障以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在一定程度上能夠自我恢復(fù)，從而減少機(jī)體損傷.

3.2 甲醛引起cAMP含量變化的機(jī)理

Peter Feick[19]等人的研究表明，低劑量甲醛對(duì)腸上皮細(xì)胞的暴露能夠?qū)е翸AP激酶的活化和整聯(lián)蛋白Paxillin酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸殘基的磷酸化，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲醛確實(shí)能夠引起cAMP含量的變化，這說明甲醛分子可能通過MAPK信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)傳遞信號(hào)，而MAPK信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞周期的運(yùn)行和基因表達(dá)具有重要調(diào)控作用[20]，所以最終甲醛分子可以引起DNA轉(zhuǎn)錄.

cAMP途徑是MAPK信號(hào)通路中非常重要的一條路線，推測(cè)甲醛通過cAMP途徑引起DNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生的機(jī)理如圖4所示，在整個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，甲醛作為信號(hào)分子首先與受體結(jié)合通過G蛋白偶聯(lián)受體活化腺苷酸環(huán)化酶(AC)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增高，從而激活下游蛋白激酶A(PKA)[21-22]，PKA激活Raf蛋白激酶，活化了的Raf 再激活Mek，Mek 經(jīng)磷酸化最終激活Erk，Erk 能夠進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，活化cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREK)，進(jìn)而啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄[23]，因此，通過甲醛染毒可引起cAMP途徑中各級(jí)激酶的異常激活，最終引起基因的異常表達(dá)，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)癌癥.

圖4 甲醛通過cAMP途徑引起DNA轉(zhuǎn)錄機(jī)理圖

4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，甲醛暴露對(duì)造血系統(tǒng)造成的毒性與信號(hào)分子途徑存在一定的關(guān)系，能夠引起胞內(nèi)信使cAMP含量的變化，這為從信號(hào)分子途徑探討白血病的致病機(jī)制提供了一些支持.

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Study on the mechanism of the change of cAMP concentration in mouse tissues induced by formaldehyde exposure

CAO Fenghua， LI Hui， ZHANG Yuchao， LIU Zhimin， MEI Yufei，SHANG Shuai， YANG Xu， DING Shumao

(Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology， College of Life Science，Central China Normal University， Wuhan 430079)

In order to explore whether formaldehyde have an effect on the metabolic regulation of hematopoietic system through the signalling pathway， SPF grade Balb/c malemice were selected as the target in this study. After a 7 day(8 h/d) dynamic and inhalational exposure to gaseous formaldehyde with three different concentrations (0.5 mg/m3， 1.0 mg/m3and 3.0 mg/m3， respectively)， the concentrations of cAMP in brain， plasma and bone marrow tissue of mice were determined. The contents of cAMP in brain tissue did not change under different concentrations of formaldehyde compared with the control group. The contents of cAMP in plasma of mice all changed compared with the control group， the 0.5， 3.0 mg/m3group appeared extremely significant difference (P<0.01)， the 1.0 mg/m3group appeared significant difference (P<0.05). The contents of cAMP in the bone marrow of all the experimental groups had significant difference compared with that of control group (P<0.05). The results indicated that the toxicity of formaldehyde on mouse hematopoietic system is related to intracellular cAMP signaling pathways．

formaldehyde; mice; cAMP; mechanism

2014-04-30.

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(51136002).

1000-1190(2015)01-0098-04

R995

A

*通訊聯(lián)系人. E-mail: dingsm@mail.ccnu.edu.cn.