甘肅省蘋果蠹蛾不同地理種群遺傳多樣性分析

張大為，羅進(jìn)倉，周昭旭，魏玉紅，劉月英

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，蘭州 730070）

蘋果蠹蛾［Cydiapomonella（L.）］屬鱗翅目，卷葉蛾科，小卷蛾亞科，以幼蟲蛀食蘋果、梨、桃、李、沙果等多種果樹的果實，造成大量落果，是水果生產(chǎn)上的毀滅性檢疫害蟲。該蟲寄主范圍廣、繁殖能力強(qiáng)、危害程度高、適應(yīng)能力強(qiáng)，是世界溫帶落葉果樹的重要害蟲［1］。蘋果蠹蛾最早起源于歐亞大陸中南部［2］，1957年在我國新疆首次被記錄為害［3］，2007 年 和2009年分別被列入中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄和全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物名單［4-5］。蘋果蠹蛾1987年傳入甘肅省酒泉地區(qū)［6］，后逐年向東擴(kuò)散，現(xiàn)已越過祁連山、烏鞘嶺等天然屏障，繼續(xù)向東傳播，在甘肅蘭州以西均有分布報道［7-8］。目前，蘋果蠹蛾有進(jìn)一步東侵的趨勢，在黑龍江、遼寧也有其發(fā)生為害報道，已對我國黃土高原和環(huán)渤海灣兩大蘋果優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)形成東西夾攻之勢，嚴(yán)重威脅我國的果品生產(chǎn)。

國內(nèi)學(xué)者對蘋果蠹蛾的研究，主要集中在生物學(xué)［9-10］、生態(tài)學(xué)［8，11-14］、綜合防治［15-19］及適生性［7，20-21］等方面，有關(guān)蘋果蠹蛾種群遺傳多樣性的研究還比較少。馮紀(jì)年等分析了10個蘋果蠹蛾地理種群，認(rèn)為已經(jīng)存在一定程度的種群分化，在我國由西向東傳播［22］；門秋雷等篩選了6個在中國蘋果蠹蛾種群中可以穩(wěn)定擴(kuò)增的微衛(wèi)星位點［23］；李玉婷等認(rèn)為河西地區(qū)蘋果蠹蛾種群遺傳多樣性較低，已經(jīng)存在一定程度遺傳分化［24］。在國外，有學(xué)者認(rèn)為，由于蘋果蠹蛾自身活動能力限制，不同種群間存在遺傳多樣性的原因是種群之間缺乏基因交流［25］。一些研究發(fā)現(xiàn)，同一個國家不同地理區(qū)域內(nèi)的蘋果蠹蛾種群之間并不存在顯著的遺傳分化［26-28］。也有些研究發(fā)現(xiàn)，即使是在相隔距離小于10km的兩個蘋果蠹蛾種群之間也存在顯著的遺傳分化［29］。因此，為探明甘肅省境內(nèi)蘋果蠹蛾不同地理種群間的遺傳分化及擴(kuò)散路徑，有必要對其分子遺傳變異情況進(jìn)行研究。本文利用9對引物對甘肅省9個不同地理種群的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，以明確甘肅蘋果蠹蛾種群間的遺傳變異、種群分化及傳播擴(kuò)散路徑，為制定蘋果蠹蛾的防控阻截策略提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

試驗用樣本均采集于2011年4-8月，在甘肅省內(nèi)蘋果蠹蛾危害區(qū)選取有代表性的果園，于果樹老翹皮下、枝干縫隙處及蛀果內(nèi)采集蘋果蠹蛾越冬代老熟幼蟲及第1代4～5齡幼蟲。采集完畢后，記錄采樣地點經(jīng)緯度等信息（表1）。采集樣本在饑餓24h后，單頭浸泡于含無水乙醇的指形管內(nèi)帶回實驗室，若液體變色則更換無水乙醇，所有樣本保存于-20℃冰箱備用。

表1 試驗樣本采集信息Table 1 Sample collection information

1.2 引物篩選

各微衛(wèi)星位點擴(kuò)增所用的引物序列參考Franck等［2］和Zhou 等［30］發(fā)表的微衛(wèi)星序列（表2），委托上海捷瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。經(jīng)過篩選，選取了9對擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性較好的引物用于對蘋果蠹蛾DNA 樣品擴(kuò)增。

1.3 基因組DNA 的提取與檢測

采用Tiangen公司DP304-2動物組織基因組DNA提取試劑盒提取單頭蘋果蠹蛾樣本總DNA，經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用尤尼柯（上海）儀器有限公司生產(chǎn)的Unico 4802H 型紫外可見分光光度計檢測，估算DNA的濃度與純度，并稀釋至45ng／μL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-100PCR 儀（MJ Research Company）上進(jìn)行，反應(yīng)體積為25μL，其中DNA 模板1μL（45ng／μL），10×PCR buffer 2.5μL，上、下游引物各0.5μL，TaqDNA聚合酶1μL，ddH2O 17.5μL。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55～60℃（根據(jù)各引物退火溫度有所不同）退火30s；72 ℃延伸30s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物于4℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增產(chǎn)物通過6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）進(jìn)行檢測，采用JY 600＋電泳儀和DYC-30型垂直電泳槽（北京六一儀器廠），電壓10V／cm，約2h，在指示劑到達(dá)膠板最底端時，結(jié)束電泳，采取硝酸銀染色法顯色，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子量marker（本研究采用PBR322DNA／Mspl，北京天根生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）標(biāo)示擴(kuò)增條帶大小，并根據(jù)結(jié)果讀帶，采用數(shù)碼相機(jī)拍照，保存膠板圖像。

表2 試驗所用9對微衛(wèi)星引物Table 2 Microsatellite primers used in this study

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

假設(shè)群體處于Hardy-Weinberg 平衡，排除模糊不清和無法準(zhǔn)確識別的條帶，對SSR 擴(kuò)增的多態(tài)性條帶，按照電泳圖譜中同一位置上DNA 帶進(jìn)行量化統(tǒng)計，有條帶的量化為1，無條帶的量化為0，生成0，1二維矩陣。利用POPGENE 1.32軟件對全部位點及全部種群和個體進(jìn)行遺傳參數(shù)分析，結(jié)合NTSYSpc 2.1軟件進(jìn)行遺傳多樣性評價［31］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蘋果蠹蛾種群的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析（表3）表明，蘋果蠹蛾9個地理種群的觀測等位基因Na為1.045 5～1.272 7，平均為1.131 3，有效等位基因Ne為1.032 1～1.192 8，平均為1.092 8，Nei氏基因多樣性指數(shù)為0.018 8～0.113 0，平均為0.054 4，Shannon指數(shù)為0.027 5～0.164 9，平均為0.106 9，多態(tài)位點百分率為4.55%～27.27%，平均為13.13%。可以看出9個種群中，蘭州七里河和臨澤種群遺傳多樣性較高，Shannon指數(shù)分別為0.164 9和0.137 4。

表3 甘肅不同地理種群蘋果蠹蛾的遺傳變異參數(shù)Table 3 Genetic variation parameters of different geographical populations of the codling moth in Gansu

2.2 遺傳相似度、遺傳距離以及地理距離相關(guān)性

利用POPGENE 1.32軟件對9個種群的遺傳相似度和遺傳距離（表4）計算發(fā)現(xiàn)，相似度在0.325 8～0.817 0之間，其中高臺種群和臨澤種群遺傳相似度最低，相互遺傳相似度最高的是甘州種群和金塔種群。

表4 甘肅不同地理種群蘋果蠹蛾遺傳距離（左下）和遺傳相似度（右上）Table 4 Genetic distance（L＋B）and genetic similarity（R＋U）between pairwise geographical populations of codling moth in Gansu Province

利用Google地理距離計算器Google maps distance calculator，獲得了9 個采樣點的直線地理距離，通過NTSYSpc軟件中的MXCOMP 程序分析遺傳距離與地理距離的相關(guān)性，得到了地理距離與遺傳距離的相關(guān)關(guān)系圖（圖1），圖中可以看出，數(shù)據(jù)分布散亂，沒有明顯的規(guī)律性，Mantel檢測結(jié)果，相關(guān)系數(shù)r＝-0.078 9，P＝0.653 0（P＞0.05），表明相關(guān)程度較低。由此可見，甘肅9個蘋果蠹蛾地理種群間的遺傳距離與地理距離間無顯著相關(guān)性。

圖1 蘋果蠹蛾9個地理種群之間遺傳距離和地理距離相關(guān)性Fig.1 Correlation between genetic distance and geographic distance among 9populations of the codling moth

2.3 聚類分析

2.3.1 UPGMA 遺傳圖譜

通過POPGENE 1.32軟件得到種群間的遺傳相似度，利用NTSYSpc 2.1軟件得到甘肅9個蘋果蠹蛾種群的UPGMA 聚類圖（圖2）?？梢钥吹?，甘州種群與金塔種群聚為一支，兩者與肅州種群合為一個分支；臨澤種群與總寨種群聚為一個分支；七里河種群與敦煌種群聚為一支；高臺種群與民勤種群聚為一支。

圖2 蘋果蠹蛾種群Nei氏遺傳相似度UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 9geographical populations of the codling moth based on Nei’s genetic identity

2.3.2 各分支遺傳多樣性統(tǒng)計

通過表5數(shù)據(jù)可以看出，在甘肅蘋果蠹蛾種群的4個分支中，分支Ⅰ即甘州、金塔、肅州種群分支的遺傳多樣性水平明顯高于其他種群分支，遺傳多樣性水平由高到低依次是分支Ⅰ＞分支Ⅳ＞分支Ⅱ＞分支Ⅲ。

2.3.3 各分支間F統(tǒng)計及基因流

種群間分化系數(shù)Fst越大表明種群分化程度越高［32］，表6 可以看出，甘肅省蘋果蠹蛾4 個種群分支的遺傳分化系數(shù)平均為0.695 6，七里河和敦煌種群分支的遺傳分化系數(shù)最高，為0.857 9，最低為臨澤與總寨種群分支的0.531 4；各分支的基因流在0.082 8～0.441 0之間，平均為0.247 2。

3 討論

遺傳多樣性可以反映一個物種適應(yīng)環(huán)境的能力，多態(tài)信息含量、Shannon指數(shù)及Nei氏基因多樣性指數(shù)均是衡量種群遺傳多樣性的指標(biāo)，當(dāng)多態(tài)信息含量＞0.5時［33］，為高度多態(tài)位點，本研究中4大分支的多態(tài)信息含量為95.45%，表明本研究所用的微衛(wèi)星標(biāo)記能夠有效地反映蘋果蠹蛾群體的遺傳多樣性變異情況。Nei氏指數(shù)和Shannon 指數(shù)表明，甘肅省蘋果蠹蛾種群4大分支的遺傳多樣性較低，且敦煌與七里河兩個種群分支遺傳多樣性最低，推測由于隨著入侵過程、遺傳漂變及瓶頸效應(yīng)的共同影響，造成遺傳多樣性的下降，與李玉婷等［24］研究結(jié)果一致。本研究中種群間的平均Fst值為0.695 6，表明種群的遺傳變異主要發(fā)生在種群間，種群內(nèi)的遺傳變異只占總變異的很少部分，與Chen和Dorn［29］、門秋雷等［23］的研究結(jié)果一致。Fis、Fit的平均值分別為0.054 9和0.181 4，表明研究的4大種群在各種群內(nèi)部存在較嚴(yán)重的近交，基因流Nm為0.247 2（＜1）說明4 個種群之間基因交流較少，與Timm 等［25］的研究結(jié)果一致，可能與蘋果蠹蛾侵入甘肅時間較短，且自身飛行擴(kuò)散能力較弱有關(guān)。

表5 甘肅蘋果蠹蛾各分支間遺傳多樣性統(tǒng)計Table 5 Genetic diversity statistics of different codling moth clades in Gansu

表6 甘肅蘋果蠹蛾4個分支的F 統(tǒng)計及基因流Table 6 F-statistics and gene flow of four population clades of the codling moth in Gansu

本研究發(fā)現(xiàn)甘肅省蘋果蠹蛾種群分布呈現(xiàn)4大分支的格局，金塔、肅州、甘州種群聚為一支；蘭州七里河種群和敦煌種群聚為一支；臨澤、總寨種群聚為一支，此3個分支應(yīng)為同一個入侵來源，其中敦煌與七里河種群遺傳多樣性最低，表明敦煌種群為最初入侵來源，七里河種群自敦煌傳播而來；高臺、民勤種群與其他3個種群遺傳距離相對較遠(yuǎn)，獨立為一支，懷疑為甘肅省蘋果蠹蛾的另一個入侵來源，各分支的遺傳關(guān)系有待于今后采集其他省份及國外種群樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析驗證。臨澤與甘州、肅州與總寨種群采集點之間的直線距離都只有十幾公里，然而幾個種群均聚為不同的分支，遺傳多樣性顯示出較大的差異，這與Chen和Dorn［29］的研究結(jié)果一致。Mantel檢測結(jié)果表明甘肅9 個蘋果蠹蛾地理種群間的遺傳距離與地理距離間無顯著相關(guān)性，與Men等［34］和李玉婷等［35］的研究結(jié)果一致。本研究采樣點均分布在國道省道附近，敦煌與七里河種群地理距離最遠(yuǎn)，七里河種群發(fā)現(xiàn)報道最晚，兩者遺傳關(guān)系最近，推測兩地是全省重要的旅游中心及交通樞紐，也進(jìn)一步印證了蘋果蠹蛾更多是通過借助外力進(jìn)行點對點傳播擴(kuò)散的可能性。

綜上，可以判定9個蘋果蠹蛾種群在甘肅省內(nèi)已經(jīng)形成一定程度的遺傳分化，入侵?jǐn)U散以人為傳播為主，總體趨勢并非自西向東，而是隨外部介質(zhì)的點對點的隨機(jī)傳播擴(kuò)散。目前，甘肅省河西地區(qū)果品產(chǎn)業(yè)規(guī)模相對較小，東部果區(qū)作為黃土高原蘋果優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)之一，在當(dāng)?shù)匾呀?jīng)形成區(qū)域特色支柱產(chǎn)業(yè)，在蘭州以東尚未有蘋果蠹蛾發(fā)生的相關(guān)報道，因此，蘋果蠹蛾的防控阻截顯得尤為重要，應(yīng)該遵循以下策略：在蘋果蠹蛾危害區(qū)，進(jìn)一步強(qiáng)化果農(nóng)對蘋果蠹蛾危害嚴(yán)重性的認(rèn)識與宣貫，做到發(fā)現(xiàn)疫情消滅疫情；全省范圍內(nèi)開展蘋果蠹蛾在其他寄主上發(fā)生的監(jiān)測與測報；進(jìn)一步強(qiáng)化疫區(qū)果品運(yùn)輸?shù)臋z驗檢疫，嚴(yán)防蘋果蠹蛾進(jìn)入非疫區(qū)。

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