云南切梢小蠹超氧化物歧化酶基因的克隆與序列分析

趙琰明，朱家穎，澤桑梓，趙 寧，楊 斌＊

（1.西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224；2.云南省林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，昆明 650224）

生物體在生命活動(dòng)過程中，特別是在逆境脅迫條件下會(huì)產(chǎn)生多種活性氧（reactive oxygen species，ROS），如超氧陰離子自由基、單線態(tài)氧、過氧化氫和羥自由基等［1］。這些活性氧具有很強(qiáng)的氧化能力，當(dāng)他們在生物體內(nèi)過量積累時(shí)可造成機(jī)體蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA 及其他細(xì)胞組分的嚴(yán)重?fù)p傷，對生物體有很大危害［2］。超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在于生物體各組織，在機(jī)體抗氧化和免疫過程中起著重要作用。它與過氧化氫酶以及過氧化物酶共同組成了保護(hù)酶系統(tǒng)［3］。當(dāng)機(jī)體內(nèi)活性氧大量積累時(shí)，SOD 就會(huì)被大量誘導(dǎo)生成，催化活性氧發(fā)生歧化反應(yīng)，生成水和過氧化氫［4］。它是唯一能夠特異性清除超氧陰離子自由基的抗氧化酶，平衡機(jī)體的氧自由基，從而起到保護(hù)機(jī)體的作用［5-6］。超氧化物歧化酶按照金屬輔基主要分為Fe-SOD、Mn-SOD 和Cu／Zn-SOD 3種，其中銅鋅超氧化物歧化酶在生物體內(nèi)分布相對廣泛，也是目前為止研究最多的超氧化物歧化酶［7］。已有研究表明銅鋅超氧化物歧化酶在生物體內(nèi)有胞內(nèi)形式（icCu／Zn-SOD）和胞外形式（ec-Cu／Zn-SOD）兩種［8］。

云南切梢小蠹（Tomicusyunnanensis）是鞘翅目（Coleoptera）小蠹科（Scolytidae）切梢小蠹屬（Tomicus）嚴(yán)重為害多種松樹的次期性蛀干害蟲［9-10］。該害蟲入侵寄主后寄主會(huì)分泌樹脂以抵御其入侵，但如果云南切梢小蠹的群集足夠快速或者寄主本身長勢比較衰弱，寄主最終會(huì)由于其抵御機(jī)制耗盡而被入侵者殺死［11-12］。對于寄主的抵御反應(yīng)，云南切梢小蠹也有自己的防御機(jī)制，而且是通過調(diào)控自身防御相關(guān)基因?qū)崿F(xiàn)的。因此，對云南切梢小蠹超氧化物歧化酶基因進(jìn)行克隆分析有助于從分子水平闡釋云南切梢小蠹在受到寄主抵御時(shí)自身的防御機(jī)制。本研究利用RACE 技術(shù)，首次克隆了云南切梢小蠹Cu／Zn-SOD cDNA 全長序列并進(jìn)行初步分析，為探索在受到寄主抵御時(shí)云南切梢小蠹的自身防御機(jī)制提供一些基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

云南切梢小蠹采自云南省曲靖市沾益縣九龍山林場。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取及RT-PCR

利用Trizol試劑（Invitrogen）提取云南切梢小蠹成蟲總RNA。總RNA 經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析其質(zhì)量后，用分光光度計(jì)測定其含量。然后以提取的總RNA 為模板，用SMART RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）試劑盒合成RACE cDNA模板。

1.2.2 SOD 基因克隆

從已構(gòu)建的云南切梢小蠹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得超氧化物歧化酶基因片段序列［13］，根據(jù)其設(shè)計(jì)3′RACE 引 物（5′-GTTGGCTTGTGCTGTTATTGGACT-3′）和5′RACE引物（5′-GTACCACCTGGTTGACTGCTTCTTGCAGTA-3′），以合成的cDNA為模板克隆獲得基因的3′和5′端序列。PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3min；94 ℃變性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸1 min，40 個(gè) 循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用QIAquick-Gel Extraction Kit（Qiagen）回收PCR 產(chǎn)物，用TA 克隆法連接入pGEM?-T-easy載體（Promega），藍(lán)白斑篩選，挑取陽性菌落進(jìn)行克隆，由上海生工生物工程有限公司測序。然后將所得序列片段拼接得到cDNA 全長序列。

1.2.3 序列分析

利用NCBI上的open reading frame finder（ORF finder）搜索開放閱讀框，GENETYX 軟件將其翻譯成氨基酸序列，并用Motifscan分析氨基酸序列中存在的結(jié)構(gòu)域。利用ClustalX 1.83進(jìn)行多序列比對分析，并利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建NJ（neighborjoining）分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

解剖云南切梢小蠹成蟲分別獲得新鮮的頭、胸、腹、足、翅，用Trizol試劑提取獲得相應(yīng)部位的總RNA，并分別提取保存于-80 ℃冰箱的云南切梢小蠹幼蟲、蛹、成蟲的總RNA，然后將各樣本總RNA定量至1μg，利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 模板。根據(jù)本次克隆獲得的云南切梢小蠹SOD 基因序列設(shè)計(jì)用于熒光定量的正向引物（5′-CTGACGGAGTAGCCACGAT-3′）和反向引物（5′-ATAACAGCACAAGCCAACC-3′）；根據(jù)華山松大小蠹和中歐山松大小蠹18SRNA 基因（GenBank 登錄號分別為KJ507200和KJ531053）的保守序列設(shè)計(jì)正向引物（5′-TTCAAATGTCTGCCTTATC-3′）和反向引物（5′-GTGGTAGCCGTTTCTCA-3′）擴(kuò)增獲得云南切梢小蠹18SRNA 基因片段，以作為內(nèi)參基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)體系（10μL）為：cDNA 模板1μL，上下游引物各0.5μL，iTaqTMUniversal SYBR Green Supermix 5μL，雙蒸水3μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min；95℃變性10s，55℃退火20s，然后讀板，39個(gè)循環(huán)；最后以每5s上升0.5 ℃的速度從65～95 ℃記錄熔解曲線，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄樣品重復(fù)3次。使用CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad，美國）進(jìn)行檢測。反應(yīng)結(jié)束后，以18SRNA 為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCT 法分析云南切梢小蠹各發(fā)育階段及不同部位SOD基因的相對轉(zhuǎn)錄水平［14］。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

不同發(fā)育階段和不同部位的SOD 基因相對表達(dá)量數(shù)據(jù)利用SPSS軟件進(jìn)行One-way ANOVA 方差分析，多重比較采用Duncan法，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

經(jīng)過測序得到云南切梢小蠹SOD cDNA 序列全長為768bp，5′端非編碼區(qū)80bp，3′端非編碼區(qū)226bp，開放閱讀框462bp。將其在GenBank中注冊，登錄號為KM278528。該基因推導(dǎo)的多肽序列為153個(gè)氨基酸（圖1）。其推導(dǎo)的氨基酸序列預(yù)測理論分子量為15.8ku，等電點(diǎn)為5.68。Motifscan分析顯示，該蛋白存在2個(gè)Cu／Zn-SOD 的特異序列（GFHIHEFGDNT42-52和GNAGGRLACAVI136-147），3個(gè)N-末端?；稽c(diǎn)（NGTV14-17、NGSL30-33、NMTD96-99），1個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)（casein kinaseⅡphosphorylation site）（TDEE73-76），4個(gè)N-端?；稽c(diǎn)（N-myristoylation site）（GSLKGL31-36、GCISAG54-59、GNIQAN83-88和GNAGGR136-141），2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（protein kinase C phosphorylation site）（SLK32-34和TDK98-100），第1～151氨基酸區(qū)域具有銅鋅超氧化物歧化酶超家族（copper／zinc superoxide dismutase superfamily）的保守結(jié)構(gòu)域。

圖2 云南切梢小蠹與其他昆蟲SOD多序列比對Fig.2 Multiple alignment of SOD sequences fromTomicus yunnanensis and other insects

2.2 氨基酸序列相似性比對及進(jìn)化樹分析

同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，云南切梢小蠹SOD 基因與中歐山松大小蠹（Dendroctonusponderosae）SOD基因在氨基酸水平上相似性高達(dá)93%，與赤擬谷盜（Triboliumcastaneum）也有71%的一致性。而與半翅目的點(diǎn)蜂緣蝽（Riptortuspedestris）、侵?jǐn)_錐獵蝽（Triatomainfestans），膜翅目的麗蠅蛹集金小蜂（Nasoniavitripennis）、佛羅里達(dá)弓背蟻（Camponotusfloridanus），鱗翅目的柑橘鳳蝶（Papilio xuthus）、棉鈴蟲（Helicoverpaarmigera），雙翅目的黑果蠅（Drosophilavirilis）、家蠅（Muscadomestica）氨基酸序列一致性也均在67%～71%之間。多序列比對分析表明，不同物種甚至不同目的昆蟲Cu／Zn-SOD 氨基酸序列存在多個(gè)高度保守區(qū)域。如圖2所示，Cu、Zn與6個(gè)組氨酸（His）殘基和1個(gè)天冬氨酸（Asp）配位，其中Cu原子分別與His44、His46、His61和His118配位，Zn原子分別與His61、His69、His78和Asp81配位。Cu、Zn共同連接His61組成“咪唑橋”結(jié)構(gòu)。半胱氨酸Cys55和Cys144之間形成了Cu／Zn-SOD中唯一一對鏈內(nèi)二硫鍵。

為了確定克隆獲得的云南切梢小蠹SOD 與其他昆蟲SOD 的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA5.0將多序列比對所得結(jié)果用臨位相連法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖3所示，克隆獲得的云南切梢小蠹SOD明顯區(qū)別于Mn-SOD，與其他昆蟲的Cu／Zn-SOD聚為一族，并且與icCu／Zn-SOD 聚在一起。

圖3 云南切梢小蠹及其他物種SOD的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of SODs fromTomicus yunnanensis and other insects

2.3 云南切梢小蠹SOD 基因在各發(fā)育階段及不同部位的表達(dá)

由圖4可以看出云南切梢小蠹SOD 基因在不同發(fā)育階段均有表達(dá)，并且在蛹期相對表達(dá)量最高，顯著高于幼蟲期和成蟲期。圖5結(jié)果表明云南切梢小蠹SOD 基因在頭、胸、腹、足、翅各個(gè)部位均有表達(dá)。其中SOD 基因在足部表達(dá)量最高，顯著高于其他部位，在頭部也有較高表達(dá)，也明顯高于剩余3個(gè)部位。而在其胸部、腹部還有翅中的表達(dá)量相對都較低，并且在這3個(gè)部位中相對表達(dá)量差異不顯著。

圖4 云南切梢小蠹不同發(fā)育階段SOD基因的相對表達(dá)量Fig.4 The relative expression levels of SOD gene in Tomicus yunnanensis at different developmental stages

圖5 云南切梢小蠹不同部位SOD基因的相對表達(dá)量Fig.5 The relative expression levels of SOD gene in different parts of Tomicus yunnanensis

3 討論

本研究利用RACE技術(shù)，克隆獲得了云南切梢小蠹超氧化物歧化酶基因。該基因與其他昆蟲SOD具有很高的相似性，這體現(xiàn)了不同昆蟲超氧化物歧化酶在進(jìn)化過程中的保守性。生物體內(nèi)Cu／Zn-SOD又可分為icCu／Zn-SOD和ecCu／Zn-SOD，兩者在催化歧化反應(yīng)時(shí)有著相同的速率和相似的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。ecCu／Zn-SOD在N 端存在一小段信號肽，為分泌型蛋白，主要存在于組織外基質(zhì)及細(xì)胞表面；icCu／Zn-SOD沒有信號肽，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中［15］。通過在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，本次所得云南切梢小蠹SOD 基因推導(dǎo)的氨基酸序列并無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，這些完全符合ic-Cu／Zn-SOD的結(jié)構(gòu)特征。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)一步分析表明，克隆所得的云南切梢小蠹SOD與icCu／Zn-SOD聚在一起。因此斷定本研究得到的云南切梢小蠹SOD為icCu／Zn-SOD。

超氧化物歧化酶（SOD）被稱為生物體抗氧化系統(tǒng)的第一道防線，其廣泛存在于生物體各個(gè)發(fā)育階段及不同的組織，在很多不同類型的細(xì)胞中均有表達(dá)［8］。云南切梢小蠹icCu／Zn-SOD 基因在其各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)，并且蛹期的表達(dá)量最高，與黃粉蟲icCu／Zn-SOD在蛹期表達(dá)量最高一致，不過在黃粉蟲幼蟲中隨著齡期的增加icCu／Zn-SOD 基因的表達(dá)量也增加，最終超過成蟲［16］。意大利蜜蜂和中華蜜蜂SOD 基因在蛹期表達(dá)量最低［17-18］，與本研究結(jié)果相反，這說明不同昆蟲在不同發(fā)育階段SOD 基因的相對表達(dá)量也不同，這可能與昆蟲自身的生活習(xí)性和環(huán)境有關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)云南切梢小蠹ic-Cu／Zn-SOD 基因在足部的表達(dá)量顯著高于頭、胸、腹、翅各部位。目前對于昆蟲足部SOD 基因表達(dá)的相關(guān)研究較少，但已有研究表明蚌類不同組織中SOD表達(dá)強(qiáng)度雖然不同，卻在斧足組織中表達(dá)最強(qiáng)，這與斧足的運(yùn)動(dòng)功能是相關(guān)的［19］。紫貽貝主要依靠閉殼肌實(shí)現(xiàn)其貝殼的開閉，是其主要的運(yùn)動(dòng)器官，因此其閉殼肌SOD含量較豐富［20］。云南切梢小蠹平時(shí)基本以足部爬行運(yùn)動(dòng)為主，極少飛行，這可能與其足部SOD基因的表達(dá)量相對較高有很大關(guān)系。

超氧化物歧化酶不僅在細(xì)胞防御活性氧機(jī)制中扮演著重要角色，同時(shí)在昆蟲、脊椎動(dòng)物甚至一些水產(chǎn)無脊椎動(dòng)物發(fā)揮先天免疫功能中也起著重要的作用［21-22］。它們能增強(qiáng)昆蟲對有毒化學(xué)物質(zhì)、熱壓、殺蟲劑還有一些微生物侵染的抵抗力［23］，在昆蟲生長發(fā)育和抗環(huán)境脅迫過程中起著巨大作用。在黃粉蟲中，SOD 在血細(xì)胞里表達(dá)量相對較高，而在角質(zhì)層和脂肪體中表達(dá)量相對較少，這可能是由于SOD參與免疫反應(yīng)，而血細(xì)胞正是昆蟲免疫系統(tǒng)的主要組成單元［16］。生命延續(xù)和抗逆性是生物體滯育期的兩個(gè)最重要特征，研究發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶在維持尖音庫蚊越冬期生命體征以及增強(qiáng)自身抗逆性中發(fā)揮著重要的作用［24］?，F(xiàn)在對于超氧化物歧化酶在寄主與寄生物相互作用過程中所起的作用已經(jīng)有所研究。超氧化物歧化酶與由活性氧誘導(dǎo)的寄生蟲致死有關(guān)，另外，寄生蟲也能通過調(diào)控寄主的超氧化物歧化酶基因來滿足自己的生存［25］。

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