新疆貝母屬藥用貝母總生物堿含量測定研究

任慧梅，張鵬葛，王 倩，盛 萍，2*，史 紅，2，張 煊

(1.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

新疆貝母屬藥用貝母總生物堿含量測定研究

任慧梅1，張鵬葛1，王 倩1，盛 萍1，2*，史 紅1，2，張 煊1

(1.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學(xué)重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

目的：探討新疆貝母屬藥用貝母中總生物堿含量測定的最佳方法，并比較其總生物堿含量差異。方法：用氯仿 ∶甲醇(4 ∶1)混合溶劑提取總生物堿；采用酸性染料比色法測定新疆貝母屬藥用貝母中總生物堿含量。結(jié)果：酸性染料選擇溴麝香草酚藍(lán)比色的顯色條件為pH 5.0緩沖液4.0 mL；氯仿萃取1次，每次2.6 mL；無水硫酸鈉脫水用量0.25 g。西貝素在 12.24～73.44 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；平均回收率101.53 %，RSD為2.67 %(n=5)。所測生物堿的含量在新疆貝母屬藥用貝母種間存在一定差異，除灘貝母和小花貝母總生物堿含量相對較低外，其余6種貝母總生物堿含量在0.589%～0.869%之間，比以往文獻(xiàn)測定的總生物堿含量均較高。結(jié)論：所建立的方法簡便、精確，重復(fù)性好，可用于新疆貝母屬藥用貝母總生物堿含量的測定，其總生物堿含量為新疆貝母屬藥用貝母資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

新疆藥用貝母；總生物堿；含量測定

貝母是一種常用中藥，在我國有悠久的用藥歷史。為百合科貝母屬(Fritillaria)多種植物的鱗莖，通常用于清熱潤肺、化痰鎮(zhèn)咳、止喘、除燥的效用[1]?！吨袊幍洹?010年版收載的貝母藥材有川貝母、浙貝母、伊貝母、平貝母及湖北貝母，其中川貝母除包括歷屆版本收錄的川貝母F.cirrhosaDon.、暗紫貝母F.unibracteataHsiao et K. C. Hsia.、甘肅貝母F.przewalskiiMaxim.et Bata.、棱砂貝母F.delavayi. Franch.4種植物外，還新收錄了太白貝母F.taipaiensisP.Y.Li和瓦布貝母F.unibracteataHsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C. Yue) Z.D. Liu,S. Wang et S.C.Chen 2種植物。伊貝母收載在《中國藥典》歷次版本中，包括新疆貝母F.walujewiiRege. 、伊犁貝母F.pallidifloraSchrenk 2種植物的干燥鱗莖[2]，在臨床應(yīng)用方面與藥材川貝母相同，是中醫(yī)處方和中成藥生產(chǎn)常用的名貴藥材。因其野生品種僅分布在新疆境內(nèi)[3]，故新疆當(dāng)?shù)厝艘渤⑿陆惸窮.walujewiiRegel.或伊犁貝母F.pallidifloraSchrenk 的干燥鱗莖統(tǒng)稱為新疆貝母。而實際上，隨著野生伊貝母藥材資源破壞嚴(yán)重，在新疆民間，同時入藥使用的貝母尚有托里貝母F.tortifoliaX. Z. Duan et X. J. Zheng、小花貝母F.meleagroidesPatrin ex Schult.、裕民貝母F.yuminensisX. Z. Duan等7種藥用貝母，幾十年來不僅供應(yīng)本區(qū)，還大量支援兄弟各省區(qū)，以彌補市場緊缺和供需矛盾，有望增補為伊貝母項下新品種，但有關(guān)其活性成分含量的對比研究鮮見?，F(xiàn)代研究證明總生物堿是貝母類藥材的主要活性成分[4]，而測定總生物堿的常用方法之一多為酸性染料比色法[5-10]，但酸性染料的選擇及顯色條件的不同對總生物堿含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確性影響較大。課題組前期對新疆貝母屬藥用貝母總生物堿含量測定選擇何種酸性染料及顯色條件進(jìn)行了詳細(xì)研究，為促進(jìn)新疆貝母屬藥用貝母的合理開發(fā)利用及資源保護(hù)，同時，為臨床合理用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

本實驗所用新疆貝母屬藥用貝母藥材均于2012-2013年5月采自新疆各產(chǎn)地，生長年限均為3年生，藥材樣品信息見表6。經(jīng)鑒定為百合科植物新疆貝母FritillariawalujewiiRegel、伊犁貝母F.pallidifloraSchrenk、托里貝母F.tortifoliaX.Z.Duan et X. J. Zheng、灘貝母F.karelinii(Fisch.) Baker.、小花貝母F.meleagroidesPatrin ex Schult.、裕民貝母F.yuminensisX. Z. Duan、黃花貝母F.verticillataWilld.、大白花貝母F.verticillatavar.albidoflora等的干燥鱗莖。憑證標(biāo)本存放于新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥資源教研室。藥材經(jīng)60 ℃烘干后粉碎，過80 目篩，備用。對照品西貝素(批號110767-201005)購于中國藥品生物制品檢定所。

AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司 )；DHG-9070型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實驗設(shè)備有限公司)；GBC-40紫外-可見分光光度計(澳大利亞產(chǎn) )；雷磁pH計；水浴鍋等。

pH 4.2溴甲酚綠溶液(用由0.1 mol·L-1的鄰苯二甲酸氫鉀與0.2 mol·L-1的氫氧化鈉配制成的pH 4.2的緩沖溶液定容裝有0.125 0 g溴甲酚綠粉末的250 mL容量瓶得到)；pH 5.0溴麝香草酚藍(lán)溶液(用由0.1 mol·L-1的鄰苯二甲酸氫鉀與0.2 mol·L-1的氫氧化鈉配置成的pH 5.0的緩沖溶液定容裝有0.1250 g溴麝香草酚藍(lán)粉末的250 mL容量瓶得到)、氯仿、甲醇、氨水、無水乙醇、無水硫酸鈉等，所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備

2.1.1 對照品溶液

精密稱取0.005 1 g西貝素置5 mL容量瓶中，用少量氯仿溶解，并用氯仿定容至刻度，從中精密移取3 mL至25 mL容量瓶中并用氯仿定容至刻度(0.122 4 mg.mL-1)，備用。

2.1.2 樣品溶液

精密稱取樣品粉末(過80目篩)約1.000 0 g置250 mL圓底燒瓶，加入濃氨試液2 mL，密塞浸潤12 h后精密加入氯仿-甲醇(4 ∶1)混合溶液30 mL，輕搖混勻，置80℃水浴加熱回流提取4 h，室溫下濾紙濾過，用氯仿-甲醇(4 ∶1)洗滌燒瓶2～3次，洗滌液一起過濾。濾液置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，60 ℃水浴上蒸干后，在60 ℃烘箱中干燥3 h，干膏加少量氯仿分次溶解，定量移入25 mL容量瓶中，加氯仿至刻度，搖勻，備用。

2.2 顯色試劑及測定波長的選擇

精密吸取西貝素對照品溶液及樣品溶液各2份，每份0.2 mL于25 mL容量瓶中，分別精密加入pH 4.2溴甲酚綠溶液和pH 5.0溴麝香草酚藍(lán)溶液4 mL，再加氯仿2.6 mL密塞，劇烈振搖5 min，移入分液漏斗中靜置分層，分取氯仿層于裝有0.25 g無水硫酸鈉的具塞錐形瓶中，于波長200～700 nm范圍內(nèi)掃描測定吸收光譜。各供試液用pH 4.2溴甲酚綠溶液和pH 5.0溴麝香草酚藍(lán)溶液顯色前后的吸收光譜見圖1。

圖1 各供試品溶液顯色前后吸收光譜

圖2 對照品與樣品測定波長的吸收光譜

重復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)，用pH 4.2溴甲酚綠顯色，西貝素對照品和樣品顯色后的λmax變化較大，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較差，不宜采用。而用pH 5.0溴麝香草酚藍(lán)顯色后，西貝素對照品和樣品λmax 不僅一致，均為414 nm，而且重現(xiàn)性好，故選用pH 5.0溴麝香草酚藍(lán)溶液顯色，測定波長選擇 414 nm。

2.3 顯色條件考察

2.3.1 緩沖溶液pH值考察

精密吸取樣品溶液5份，每份 0.2 mL于25 mL容量瓶中，分別精密加入pH 4.6、 4.8、 5.0、5.2、5.4溴麝香草酚藍(lán)溶液4 mL，再加入氯仿2.6 mL，依法在414 nm下測定吸光度。結(jié)果見表1。結(jié)果顯示用pH 5.0溴麝香草酚藍(lán)溶液顯色，吸光度最大。

表1 緩沖溶液pH 值考察

2.3.2 酸性染料用量考察

精密吸取樣品溶液5份，每份 0.2 mL于25 mL容量瓶中，分別精密加入pH 5.0的溴麝香草酚藍(lán)溶液2、3、4、5、6 mL，再加入氯仿2.6 mL，依法在414 nm下測定吸光度。結(jié)果見表2。結(jié)果顯示用pH 5.0溴麝香草酚藍(lán)溶液用量為4 mL時，已能使生物堿與其完全結(jié)合，被充分萃取，吸光度達(dá)到最大。

表2 酸性染料用量考察

2.3.3 氯仿用量考察

精密吸取樣品溶液5份，每份 0.2 mL于25 mL容量瓶中，分別精密加入pH 5.0的溴麝香草酚藍(lán)溶液4 mL，再分別加入氯仿2.4、2.5、2.6、2.7、2.8 mL，依法在414 nm下測定吸光度。結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，氯仿用量達(dá)2.6 mL時，即可將生物堿與酸性染料的絡(luò)合物基本萃取完全。

表3 氯仿用量考察

2.3.4 顯色穩(wěn)定性

精密吸取樣品溶液0.2 mL于25 mL容量瓶中，精密加入pH 5.0的溴麝香草酚藍(lán)溶液4 mL、氯仿2.6 mL，依法在414 nm下測定吸光度。結(jié)果見表4。由結(jié)果可知，氯仿萃取液放置30 min 基本穩(wěn)定。

表4 顯色穩(wěn)定性考察

2.3.5 無水硫酸鈉用量考察

精密吸取樣品溶液5份，每份 0.2 mL于25 mL容量瓶中，分別精密加入pH 5.0的溴麝香草酚藍(lán)溶液4 mL，氯仿2.6 mL，劇烈振搖5 min，靜置分層于裝有0.20、0.25、0.30 g無水硫酸鈉的具塞錐形瓶中，于414 nm的波長下測定吸光度。結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，當(dāng)用量為0.25 g時吸光度較為理想，用量過少，不能起到吸收水分的作用，用量過大會吸附生物堿絡(luò)合物。

表5 無水硫酸鈉用量考察

2.3.6 線性關(guān)系考察

從西貝素對照品溶液(0.122 4 mg·mL-1)中精密吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 與0.6 mL分別至25 mL容量瓶中，分別精密加入pH 5.0的溴麝香草酚藍(lán)溶液4 mL、氯仿2.6 mL，密塞，振搖均勻后，移入分液漏斗中靜置30 min，分取氯仿層于裝有0.25 g無水硫酸鈉的具塞錐形瓶中，在414 nm 處測定吸光度。以西貝素量μg為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：

A=0.008 7C+0.057 3(R2=0.999 1)，結(jié)果表明西貝素在 12.24～73.44 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.7 精密度考察

精密吸取對照品溶液5份，每份0.2 mL于25 mL容量瓶中，按樣品含量測定項下方法測定吸光度。結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.3.8 重現(xiàn)性考察

取同一樣品粉末5份，每份約1.000 0 g，精密稱定，按樣品溶液制備項下方法進(jìn)行制備。精密吸取0.2 mL于25 mL容量瓶中，按樣品含量測定項下方法測定吸光度。結(jié)果表明，該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.9 穩(wěn)定性考察

取同一樣品粉末，分別于配置溶液后0、1、2、3、4、6、8 h, 精密吸取0.2 mL至25 mL容量瓶中，加pH 5.0的溴麝香草酚藍(lán)4 mL，氯仿2.6 mL，按樣品含量測定項下方法測定吸光度，平均值為0.452，RSD為0.8%。結(jié)果表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.10 回收率試驗

取已知總生物堿含量的樣品粉末(總生物堿含量為0.65%) 5份，每份0.5 g，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，分別精密吸取含有西貝素80%、100%、120%樣品中總生物堿量加入樣品中，按樣品溶液制備項下方法進(jìn)行制備，按樣品含量測定項下方法測定吸光度，計算平均回收率為101.53 % (n=5)，RSD為2.67 % 。

2.3.11 樣品含量測定

精密稱取樣品粉末(過80目篩)約(約1.000 0 g)，精密稱定，置250 mL圓底燒瓶中，加濃氨試液2 mL，浸潤12 h。精密加入三氯甲烷-甲醇(4 ∶1)混合溶液30 mL，混勻，置80 ℃水浴加熱回流提取4 h，放冷，用單層濾紙濾過，用三氯甲烷-甲醇(4 ∶1)混合溶液洗滌2～3次圓底燒瓶，洗滌液與樣品液一起過濾后，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在60 ℃水浴上蒸干后，于烘箱中60 ℃干燥3 h，殘渣加少量氯仿分次溶解，定量移入25 mL容量瓶中，加氯仿至刻度，搖勻。精密吸取0.2 mL于25 mL容量瓶中，加入pH 5.0的溴麝香草酚藍(lán)溶液4 mL、氯仿2.6 mL，密塞，振搖均勻后，移入分液漏斗中靜置，分取氯仿層于裝有0.25 g無水硫酸鈉的具塞錐形瓶中，在414 nm 處測定吸光度，計算含量，結(jié)果見表6。

表6 新疆貝母屬藥用貝母總生物堿含量測定結(jié)果(n=5)

3 討 論

3.1 酸性染料比色法是測定總生物堿常用方法之一[5-10],它是在適當(dāng)?shù)膒H介質(zhì)中，生物堿與氫離子結(jié)合成鹽，酸性染料在此介質(zhì)中解離出陰離子，同時，陽離子和陰離子又能定量地結(jié)合成有色的離子對，離子對能被合適的有機溶劑提取形成有色溶液，因而可以供比色時測定含量。但酸性染料的選擇對含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確性影響較大，我們在參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-10]基礎(chǔ)上，對酸性染料溴甲酚綠和溴麝香草酚藍(lán)進(jìn)行了篩選。根據(jù)對照品和樣品顯色后的λmax,以及重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，選擇溴麝香草酚藍(lán)為酸性染料，可以較好地保證測定結(jié)果的重現(xiàn)、穩(wěn)定和準(zhǔn)確可靠。

3.2 采用酸性染料比色法測定總生物堿含量時，緩沖溶液pH值、酸性染料用量以及氯仿用量用量等方面對測定結(jié)果影響很大[5-10]，因此，我們對以上顯色條件進(jìn)行了詳細(xì)的考察，結(jié)果以pH 5.0的溴麝香草酚藍(lán)用量為4.0 mL時最佳。另外，為了能夠?qū)崿F(xiàn)生物堿和生物堿苷與酸性染料的絡(luò)合物被氯仿充分萃取出來，本研究經(jīng)試驗篩選，氯仿用量為2.6 mL時萃取效果最佳。

3.3 試驗中排除氯仿萃取液中水分的影響對試驗測定結(jié)果至關(guān)重要,由于大量的無水硫酸鈉對絡(luò)合物有一定的吸附作用, 我們對無水硫酸鈉的用量也進(jìn)行了試驗考察，結(jié)果以使用0.25g的無水硫酸鈉脫水效果最佳。

3.4 目前國內(nèi)文章中有關(guān)測定新疆藥用貝母品種總生物堿含量的報道有文獻(xiàn)[11-13]，測定總生物堿的方法有兩相滴定法、酸性染料比色法和非水滴定法，但測定的總生物堿含量均較本試驗低。在文獻(xiàn)[11]中采用兩相滴定法，新疆貝母Fritillariawalujewii總生物堿含量為0.117%；在文獻(xiàn)[12]中分別采用兩相滴定法、酸性染料比色法和非水滴定法，伊犁貝母Fritillariapallidiflora總生物堿含量分別為0.121%、0.087%、0.291%；1990年李萍在21種貝母總生物堿含量測定[13 ]中采用酸性染料比色法，測定出伊犁貝母Fritillariapallidiflora、新疆貝母F.walujewii、托里貝母F.tortifolia、灘貝母F.karelinii、小花貝母F.meleagroides、裕民貝母F.yuminensis總生物堿的含量分別為0.2%～0.27%、0.16%～0.20%、0.13%、0.16%、0.24%和0.20%。比較上述文獻(xiàn)資料，本實驗在對選擇何種酸性染料及顯色條件進(jìn)行詳細(xì)考察篩選后，測定到的新疆貝母屬藥用貝母總生物堿含量達(dá)到0.491%～0.869%之間，其中，藥典收錄的2個品種總生物堿含量達(dá)到0.718%～0.869%之多。

3.5 比較新疆貝母屬8種藥用貝母之間總生物堿含量，除灘貝母(0.501%)和小花貝母(0.491%)總生物堿含量相對較低外，其余6種貝母總生物堿含量在0.589%～0.869%之間。其中，裕民貝母(0.841%)、黃花貝母(0.619%～0.674%)、托里貝母(0.651%)、大白花貝母(0.589%)與藥典收錄的新疆貝母(0.721%～0.771%)和伊犁貝母(0.718%～0.869%)2個品種總生物堿含量差異較小。但是否可增補為藥典品種，尚需結(jié)合《中國藥典》伊貝母質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下要求和藥效試驗進(jìn)一步研究。目前，對其這方面的研究工作正在進(jìn)行中。同時，本研究結(jié)果為進(jìn)一步合理開發(fā)利用新疆貝母屬藥用貝母資源提供了重要理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M]. 北京：科學(xué)出版社，1980:97-116.

[2] 國家藥典委員會. 中國藥典:一部[S]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010:132.

[3] 新疆生物土壤沙漠研究所. 新疆藥用植物志[M]. 烏魯木齊：新疆人民出版社，1977：186-199.

[4] 李 萍，季 暉， 徐國鈞，等. 貝母類中藥的鎮(zhèn)咳祛痰作用研究[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報, 1993, 24(6):360-362.

[5] 梁生旺,生物堿類成分分析[M].北京:學(xué)苑出版社,1999:26.

[6] 翟西峰，李大龍，馮永輝，等. 伊貝母不同組織培養(yǎng)物中總生物堿和西貝母堿含量比較[J]. 中草藥, 2001,32(1):31-33.

[7] 王沖之，孫健，李萍. 貝母類藥材生物堿及生物堿苷含量測定方法學(xué)研究[J]. 藥學(xué)雜志, 2003, 38(6): 415-417.

[8] 趙高瓊， 任波， 張樂樂，等. 瓦布貝母莖葉和鱗莖中生物堿的對比[J]. 中成藥, 2013,35 (8) :1729-1732.

[9] 上官一平,傅靜芝. 酸性染料比色法測定川貝母中貝母素甲含量[J].中南藥學(xué), 2006 ,4 (2 ):130-133.

[10] 李松林,李萍. 貝母及其制劑內(nèi)在質(zhì)量評價研究進(jìn)展[J].中草藥, 1999,30(10):791-794.

[11] 王曙，徐小平，李濤. 川貝母與其它貝母類藥材總生物堿和總皂苷的含量測定與比較[J]. 中國中藥雜志, 2002，27(5):342-344.

[12] 李萍，曾令杰，李松林. 無紫外吸收的貝母總生物堿定量分析方法研究[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2002, 37(8): 614-617.

[13] 李萍，季暉， 徐國鈞，等. 21種貝母總生物堿含量測定[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報,1990,21(5):319-322.

Studies on Determination of Total Alkaloids in MedicinalFritillaria from the Genus Xinjiang Fritillaria

Ren Huimei1, Zhang Pengge1, Wang Qian1,Sheng Ping1，2*, Shi Hong1，2, Zhang Xuan1

(1.Xinjiang Key Laboratory of Famous Prescription and Science of Formulas, Urumqi 830011, China;2.School of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

Objective: To investigate the optimum method of determination of total alkaloids in medicinal Fritillaria from the genus Xinjiang Fritillaria, and a difference of total alkaloids contents in different species medicinal Fritillaria from the genus Xinjiang Fritillaria were compared. Methods: The contents of total alkaloid in medicinal Fritillaria from the genus Xinjiang Fritillaria were determined by acid dye colorimetry. Results： Bromothymol blue was selected as acid dye colorimetry, and acid dye color conditions：pH 5.0 buffer 4.0 mL. Chloroform extraction with 2.6 mL, and anhydrous sodium sulfate 0.25 g. Sipeimine in 12.24～73.44 μg range good linear relationship，average recovery was 101.53%，RSD was 2.67% (n=5)．There existed a little differences in total alkaloids contents in different species medicinal Fritillaria from the genus Xinjiang Fritillaria. Total alkaloids contents in 6 species medicinal Fritillaria from the genus Xinjiang Fritillaria were from 0.589 to 0.869 percent, while Total alkaloids contents inF.karelinii(Fisch.) Baker. andF.meleagroideswere relatively lower. Generally speaking, they all was relatively higher in total alkaloids contents between this study and previous literature. Conclusion：The method is simple，accurate, reproducible and can be used to determine total alkaloids in medicinal Fritillaria from the genus Xinjiang Fritillaria. This provided a scientific basis for exploitation and utilization of medicinal Fritillaria from the genus Xinjiang Fritillaria in the future with high content of alkaloids.

Medicinal Fritillaria from Xinjiang; total alkaloids; quantitative determination

2014-09-15

國家自然科學(xué)基金資助項目( 81160544)。

任慧梅(1989—)，女，在讀碩士研究生。研究方向：從事特色中藥資源質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。

*通訊作者：盛萍(1967—)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：特色中藥資源質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail: xjsphwy@163.com

10.3969/j.issn.1006-9690.2015.02.007

R284.1

A

1006-9690(2015)02-0024-05