miR-487a增加MCF-7/MX荷瘤鼠對米托蒽醌敏感性機(jī)制探討*

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科(沈陽 110001)

關(guān) 舒 于鑫淼 毛曉韻 魏敏杰△ 金 鋒 何 苗

miR-487a增加MCF-7/MX荷瘤鼠對米托蒽醌敏感性機(jī)制探討*

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科(沈陽 110001)

關(guān) 舒 于鑫淼 毛曉韻 魏敏杰△金 鋒 何 苗

目的：研究miR-487a調(diào)控米托蒽醌(MX)耐藥的乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX荷瘤鼠對MX敏感性的作用與機(jī)制。方法：通過裸鼠腋窩皮下接種MCF-7/MX細(xì)胞構(gòu)建荷瘤鼠模型；real-time RT-PCR、Western blot方法檢測荷瘤鼠瘤體內(nèi)注射miR-487a agmir后對移植瘤內(nèi)miR-487a及BCRP表達(dá)的影響；并通過對荷瘤鼠尾靜脈注射MX后移植瘤體積和瘤重的檢測，研究miR-487a對MCF-7/MX荷瘤鼠藥物敏感性的影響。結(jié)果：在MCF-7/MX細(xì)胞荷瘤鼠瘤體內(nèi)注射miR-487a agmir誘導(dǎo)miR-487a表達(dá)增高約7倍；降低了移植瘤內(nèi)的BCRP的mRNA和蛋白表達(dá)約30%；且顯著降低了MX處理的MCF-7/MX細(xì)胞荷瘤鼠移植瘤的重量，即增加了對MX的敏感性。結(jié)論：miR-487a抑制了MCF-7/MX細(xì)胞荷瘤鼠的BCRP表達(dá)，增加其對米托蒽醌的敏感性。

米托蒽醌(MX)是常見的乳腺癌治療用藥，但化療過程中出現(xiàn)的耐藥問題嚴(yán)重影響了其臨床療效和患者的預(yù)后。miRNA是一種大小約21-25bp的單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，為一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA。miRNA通過與特定靶基因的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)特異結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的蛋白翻譯過程調(diào)控基因的表達(dá)[1]。近些年，miRNA調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞耐藥的作用引起廣大學(xué)者的關(guān)注[2,3]。本實驗對裸鼠進(jìn)行米托蒽醌(MX)耐藥的乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/MX皮下注射，構(gòu)建了在體移植瘤模型，檢測荷瘤鼠瘤體內(nèi)注射miR-487a agmir后對移植瘤內(nèi)miR-487a及BCRP表達(dá)的影響；并以MX處理上述模型后，觀察小鼠對MX的敏感性改變，探討荷瘤鼠水平時miRNA-487a對BCRP介導(dǎo)的乳腺癌耐藥作用的調(diào)控及可能機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞培養(yǎng) 米托蒽醌(MX)耐藥的MCF-7人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7/MX)，在含10%的FBS、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM(Invitrogen, USA)培養(yǎng)基，5% CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MCF-7/MX細(xì)胞系培養(yǎng)時需定時加入MX誘導(dǎo)耐藥。

2 裸鼠移植瘤模型建立 BALB/c無胸腺雌性裸鼠(4～6周齡)，飼養(yǎng)在中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級動物室。將MCF-7/MX細(xì)胞(8×106)懸浮于PBS中，200 μl接種到裸鼠的腋窩皮下。當(dāng)腫瘤平均體積大小達(dá)到約100～200mm3時，將移植裸小鼠隨機(jī)分成2組(每組n=6)：陰性對照組(NC)agmir組和miR-487a agmir，兩組小鼠分別瘤體內(nèi)注射1nM的NC agmir和miR-487a agmir(RiboBio, China)，每周兩次，共5次注射。

在考察miR-487a對MX的抗腫瘤作用影響的實驗中，將荷瘤鼠隨機(jī)分成3組(每組n=6)：NC agmir，NC agmir + MX和miR-487a agmir + MX治療組，3組小鼠分別瘤體內(nèi)注射1 nM 的NC agmir和miR-487a agmir(RiboBio, China)，每周兩次，共5次注射。NC agmir+ MX和miR-487a agmir+ MX治療組小鼠，同時給予每周兩次尾靜脈注射MX(1.5 mg/kg)，共5次注射。

3 qRT-PCR分析 qRT-PCR方法檢測BCRP的mRNA表達(dá)。RNA提取試劑盒提取移植瘤總RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR體系：100 ng RNA、50 μM Oligo dT、dNTPs各0.125 mM、60 U/μl M-MLV、1 U/μl RNA酶抑制劑、5×RT 緩沖液；條件：42℃ 30min、85℃ 5min、4℃恒溫。PCR體系：1 μl cDNA、6.25 μl 2×SYBR、0.25 μl ROX、1 μl上下游引物(10 μM)、3 μl ddH2O；PCR條件：95℃ 預(yù)變性2min，95℃30s、60℃45s、72℃30s8個循環(huán)，95℃30s、56℃45s、72℃30s35個循環(huán)，β-actin用作內(nèi)參。mRNA的變化情況用2-ΔΔCT計算和表示。實驗至少重復(fù)3次取平均值。

4 Western-Blot 分析 將裸鼠腫瘤組織經(jīng)超聲勻漿，提取蛋白。蛋白定量后，與上樣緩沖液混合(1∶5)，煮沸變性。10%SDS-PAGE電泳后，濕轉(zhuǎn)過夜。5%脫脂奶粉室溫封閉1h。一抗BCRP(1∶1000, Abcam)，4℃過夜。二抗(1∶3000，Santa Cruz Biotechnology)，室溫1 h孵育。ECL化學(xué)發(fā)光。

結(jié) 果

1 miR-487a agmir誘導(dǎo)MCF-7/MX荷瘤鼠移植瘤內(nèi)miR-487a高表達(dá) 我們在4～6周雌性裸鼠的肩胛處皮下注射MCF-7/MX細(xì)胞懸液(8×106)制備移植瘤模型，當(dāng)移植瘤體積達(dá)到約100～200mm3時，瘤內(nèi)注射miR-487a agmir或NC agmir。4周后，應(yīng)用real-time RT-PCR檢測移植瘤內(nèi)miR-487a的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR-487a agmir轉(zhuǎn)染組miR-487a的表達(dá)約為NC組的7倍，表明瘤體內(nèi)多點注射轉(zhuǎn)染miR-487a agmir可誘導(dǎo)荷瘤鼠移植瘤組織miR-487a持續(xù)高表達(dá)(P<0.05)。

2 miR-487a agmir抑制MCF-7/MX荷瘤鼠移植瘤的BCRP表達(dá) 我們通過real-time RT-PCR和Western blot分別檢測了移植瘤內(nèi)BCRP的mRNA和蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)：與NC組相比，miR-487a agmir轉(zhuǎn)染組中BCRP mRNA表達(dá)水平降低約30%(P<0.05)；miR-487a agmir轉(zhuǎn)染組中BCRP 的蛋白表達(dá)也受到明顯的抑制。表明miR-487a可抑制MCF-7/MX荷瘤鼠的乳腺癌耐藥蛋白BCRP的表達(dá)。

3 miR-487a agmir增強(qiáng)MCF-7/MX細(xì)胞荷瘤鼠對MX的敏感性 上述實驗證實了miR-487a agmir能夠抑制MCF-7/MX細(xì)胞荷瘤鼠移植瘤內(nèi)BCRP的表達(dá)，為了考察其是否因此而增強(qiáng)荷瘤鼠對MX的敏感性，我們檢測了miR-487a agmir瘤體內(nèi)注射的MCF-7/MX細(xì)胞荷瘤鼠，給予尾靜脈注射MX后移植瘤的生長情況。荷瘤第31天實驗結(jié)束，處死小鼠，取瘤組織稱重發(fā)現(xiàn)：與miR-NC+MX組相比，miR-487a agmir+MX組的瘤重減輕更明顯。表明miR-487a agmir增強(qiáng)了MX對荷瘤鼠重量的抑制作用。這些結(jié)果證實了miR-487a agmir增強(qiáng)了MCF-7/MX細(xì)胞荷瘤鼠對MX的敏感性。

討 論

乳腺癌耐藥蛋白(BCRP/ABCG2)是三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白(Adenosine triphosphate binding cassette transporters, ABC)家族中的重要成員之一，由ABCG2基因編碼[4]，可特異性將米托蒽醌等轉(zhuǎn)運底物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，最終引起腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性下降，即產(chǎn)生多藥耐藥(MDR)[5]。miRNA作為非編碼RNA之一，主要通過與目標(biāo)mRNA分子的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)特異結(jié)合，然后在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的翻譯和表達(dá)。若其靶基因為原癌基因，調(diào)控其表達(dá)的miRNA則發(fā)揮抑癌基因的活性；相反，如靶基因為抑癌基因，則調(diào)控其表達(dá)的miRNA作為癌基因發(fā)揮作用。因此，miRNA對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著非常重要的調(diào)控作用，約60%的基因表達(dá)由miRNA調(diào)控。

有細(xì)胞實驗證實了某些miRNA可調(diào)節(jié)BCRP的表達(dá)，如Wang等[6]在胰腺癌中發(fā)現(xiàn)hsa-miR-520h下調(diào)BCRP的表達(dá)，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，侵襲和干性。但是在動物實驗中相關(guān)研究報道不多。于是，本實驗參照J(rèn)in等[7]的方法，將MCF-7/MX細(xì)胞進(jìn)行裸鼠皮下接種7d移植瘤長到約100～200mm3后，將1 nmol的miR-487a agmir進(jìn)行裸鼠移植瘤內(nèi)多點注射，同時給予尾靜脈注射MX(1.5 mg/kg)處理，發(fā)現(xiàn)miR-487a agmir注射后可使瘤組織內(nèi)miR-487a表達(dá)增加，提示可通過瘤體內(nèi)多點注射的方式使miR-487a在體內(nèi)持續(xù)高表達(dá)。且我們發(fā)現(xiàn)瘤體內(nèi)注射miR-487a agmir后可使瘤組織BCRP表達(dá)下調(diào)，移植瘤的重量下降，即增加MX抑制腫瘤生長的作用。有力的證明了miR-487a在調(diào)控乳腺癌細(xì)胞BCRP表達(dá)及藥物敏感性方面具有重要作用，同時為荷瘤鼠在體轉(zhuǎn)染miRNAs進(jìn)行靶向調(diào)控乳腺癌BCRP表達(dá)與功能的研究，提供了切實可行的實驗方法。

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[4] Karibe T, Hagihara-Nakagomi R, Abe K,etal. Evaluation of the Usefulness of Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) Knockout Mice andBCRP Inhibitor-Treated Monkeys to Estimate the Clinical Impact of BCRP Modulation on the Pharmacokinetics of BCRP Substrates[J]. Pharm Res,2015, 32(5):1634-1647.

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(收稿：2015-07-19)

The study of mechanisms of miR-487a on increasing the sensitivity of xenograft mice induced by MCF-7/MX cells to mitoxantrone (MX) Department of Breast Surgery, the First Hospital of China Medical University

(Shenyang 110001)

Guan Shu Yu Xinmiao Mao Xiaoyun et al

Objective: To explore the action and mechanisms of miR-487a on the sensitivity of xenograft mice induced by MCF-7/MX cells to MX. Methods: The xenograft mice were constructed by inoculating subcutaneously MCF-7/MX cells into the flank of nude mice. The expression of miR-487a and breast cancer resistance protein (BCRP) in xenograft tumors induced by MCF-7/MX cells after injecting miR-487a agmir were examined by real-time RT-PCR and Western blot analysis. The sensitivity of xenograft mice induced by MCF-7/MX cells to MX was analyzed by observing the changes of the tumor weight. Results: The intratumoral injections of miR-487a agmir induced the increases of miR-487a by 7 fold, decreased the mRNA and protein expression of BCRP by 30%, and significantly reduced the tumor weight of the xenograft mice. Concluslon: miR-487a can inhibit the expression of BCRP and increase the sensitivity of xenograft mice induced by MCF-7/MX cells to MX.

Breast neoplasms @microRNAs Animals,laboratory Rats Nude

*國家自然科學(xué)基金(81102472, 81341063, 81201886)

乳腺腫瘤 @microRNAs 動物，實驗 大鼠，裸

R655.8

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.12.002

沈陽市科技計劃項目(F12-148-9-00)

△通訊作者:中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室