星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法在測(cè)定玄七通痹膠囊中黃芪甲苷含量的應(yīng)用*

付寶慧　濮存海

江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校(徐州221116)

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法在測(cè)定玄七通痹膠囊中黃芪甲苷含量的應(yīng)用*

付寶慧濮存?！?/p>

江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校(徐州221116)

目的：采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選玄七通痹膠囊中黃芪甲苷含量測(cè)定的色譜條件。方法：以乙腈與水的比例，蒸發(fā)室溫度和氮?dú)獾牧魉贋榭疾煲蛩兀苑迕娣e、分離度、對(duì)稱度為考察指標(biāo)，進(jìn)行總評(píng)歸一化，并進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，用效應(yīng)面法選擇較佳工藝條件，并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果：確定黃芪甲苷的色譜條件為乙腈-水33：67，蒸發(fā)室溫度為90 ℃，氮?dú)饬魉贋?.4 SLM。結(jié)論：星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選玄七通痹膠囊中黃芪甲苷含量測(cè)定的色譜條件，方法簡(jiǎn)便，預(yù)測(cè)性良好。

玄七痛痹膠囊是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效制劑，2003年被列入國(guó)家科技部火炬計(jì)劃項(xiàng)目。該制劑由六味藥組成，黃芪為方中臣藥，具有增強(qiáng)免疫、抗疲勞、促進(jìn)代謝等功用[1]。其活性成分主要為皂苷類，黃芪甲苷是其主要活性成分之一，該制劑主要通過(guò)測(cè)定黃芪甲苷的含量對(duì)成品質(zhì)量進(jìn)行控制[2]。為了建立更準(zhǔn)確的黃芪甲苷高效液相-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC-ELSD)含量測(cè)定方法，本文采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)其色譜條件進(jìn)行優(yōu)選。該方法是集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)于一體的效應(yīng)面優(yōu)選法，有較強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)精確度，能夠建立較好的數(shù)學(xué)模型，還能考察各因素之間的相互作用[3]。本次研究旨在優(yōu)選黃芪甲苷含量測(cè)定色譜條件的同時(shí)，為探討該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法應(yīng)用于優(yōu)選中藥含量測(cè)定時(shí)色譜條件的可行性提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

高效液相色譜儀(日本島津，帶自動(dòng)進(jìn)樣器)；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(PL-ELS2100英國(guó))；LC-Solution色譜工作站；Hypersil-ODS柱(4.6×250 mm，5 μm)；黃芪甲苷對(duì)照品(0781-9908，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；玄七通痹膠囊(111201，111202，111203，自制)；乙腈為色譜純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件的優(yōu)選

2.1.1對(duì)照品溶液的制備：用甲醇制成每1 mL含0.2 mg黃芪甲苷的對(duì)照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備：精密稱取玄七通痹膠囊內(nèi)容物約2 g，加甲醇提取4h，提取液蒸干，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次15 mL，合并正丁醇層，用氨試液洗滌兩次，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀谷芙?，用三氯甲烷萃取，揮去三氯甲烷，通過(guò)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱，用水洗脫，繼用40%乙醇洗脫，再用70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液，蒸干后用甲醇定容到一定濃度作為供試品溶液。

2.1.3星點(diǎn)設(shè)計(jì)：通過(guò)預(yù)試驗(yàn)可知，確定流動(dòng)相乙腈與水的比例、蒸發(fā)室溫度及其氮?dú)饬魉俑髯畲笾底钚≈岛?，每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平，用代碼值±α、±1、±0來(lái)表示，α=1.732，因素水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)方案見(jiàn)表2。

表1　星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表

表2　星點(diǎn)試驗(yàn)安排及效應(yīng)值

注：實(shí)驗(yàn)15～20用均值表示，因其是重復(fù)性試驗(yàn)

2.1.4數(shù)據(jù)處理：將峰面積、分離度、對(duì)稱度均標(biāo)準(zhǔn)化為0～1之間的歸一值，各指標(biāo)“歸一值”求算幾何平均數(shù)，得總評(píng)“歸一值”(OD)。公式如下：OD = (d1d2…dk)1/kk 為指標(biāo)數(shù)，dmin = (Ymax -Yi )/ (Ymax -Ymin )。

2.1.5模型擬合與結(jié)果：采用design expert 7.1得到回歸方程，y=124.25-4.76A-3.11B+29.21C+0.13AB-1.66AC-7.83BC+0.03A2+0.01B2-0.57C2-9.26A2B+0.026A2C-3.26AB2(R2=0.9288，R2adj=0.8066，r=0.9637)。模型方差P<0.05，說(shuō)明該模型具有顯著性。本實(shí)驗(yàn)以此方程作為分析及預(yù)測(cè)的模型，得到如下的效應(yīng)面三維圖。見(jiàn)圖1～3。從圖1可以看出，當(dāng)?shù)獨(dú)饬魉僭黾拥?.65 SLM時(shí)，其對(duì)OD值增加的影響已不顯著，且如果氮?dú)饬魉倮^續(xù)增加，OD值將降低；蒸發(fā)室溫度與氮?dú)饬魉俪守?fù)性相關(guān)，說(shuō)明試驗(yàn)中若要升高蒸發(fā)室的溫度，相應(yīng)地也要降低氮?dú)獾牧魉佟膱D2可以看出，當(dāng)溫度大于90 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，總評(píng)歸一值OD就會(huì)相應(yīng)的增大；當(dāng)溫度小于90 ℃時(shí)，隨著溫度的降低，總評(píng)歸一值OD就會(huì)相應(yīng)的增大。從圖3可以看出，當(dāng)流動(dòng)相乙腈增加到34.24時(shí)，OD值開(kāi)始下降；AC呈負(fù)相關(guān)。從圖上可以直接讀取的較優(yōu)范圍為：A：乙腈32.65～34.24，B：90～120 ℃，C：1.38～1.65 SLM，最后預(yù)測(cè)出的最佳工藝為流動(dòng)相乙腈-水(33∶67)，蒸發(fā)室溫度90 ℃，氮?dú)饬魉?.4 SLM。

2.2方法學(xué)考察

2.2.1線性關(guān)系考察：稱取黃芪甲苷對(duì)照品30 mg，精密稱定，置于15 mL量瓶中，用甲醇溶解后定容至刻度，即得到每1 mL甲醇含2.08 mg黃芪甲苷的對(duì)照品溶液，作為母液，精密吸取母液2.5 mL3份，分別置于5mL、10mL、20 mL量瓶中，用甲醇定容，得1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)溶液，另精密吸取母液1.25 mL，置于20 mL量瓶中，用甲醇定容，得4號(hào)溶液，另精密吸取4號(hào)溶液5 mL，置于10 mL量瓶中，得5號(hào)溶液，20 μL進(jìn)樣，數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖4。結(jié)果表明：黃芪甲苷在1.3 μg～41.6 μg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好?；貧w方程為：y= 1.5657X+5.1267，r=0.999。

表3　繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)

2.2.2專屬性試驗(yàn)：分別取對(duì)照品溶液、樣品溶液及陰性樣品(不含黃芪，按制法制備)，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，色譜圖顯示樣品中黃芪甲苷的保留時(shí)間與對(duì)照品的相同，陰性無(wú)干擾。

2.2.3精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，按優(yōu)選出的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果平均峰面積為5929806，RSD為1.65%。

2.2.4重復(fù)性試驗(yàn)：取玄七通痹膠囊同一個(gè)批號(hào)(111201)的樣品6份各2g，精密稱定，照供試品溶液制備方法制備，即得。照上述色譜條件，精密吸取20μL注入色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣2次測(cè)定，計(jì)算黃芪甲苷的含量，結(jié)果黃芪甲苷的平均含量為466.44 μg/g，RSD為1.51%。

2.2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)中的第1個(gè)樣品，每隔3h進(jìn)樣1次，0h、3h、6h、9h、12h、15 h，共計(jì)進(jìn)樣6次，測(cè)定其穩(wěn)定性。結(jié)果平均峰面積為4543510，RSD為1.94%。

2.2.6加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的玄七通痹膠囊(111201)1g，按相當(dāng)于含黃芪甲苷的80%、100%、120%的量加入，每個(gè)濃度平行3份，制備加樣的樣品液，相同色譜條件測(cè)定，每份進(jìn)2針，結(jié)果平均加樣回收率分別為101.69%、97.91%、100.4%，RSD分別為1.10%、0.53%、1.91%。

2.2.7藥材的含量測(cè)定：按2010年版《中國(guó)藥典》方法制備黃芪藥材供試品溶液，如上的色譜條件對(duì)3個(gè)批號(hào)的藥材進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)批號(hào)平行制備2份，進(jìn)樣，每份進(jìn)2針。結(jié)果藥材的平均含量為1.683 mg/g。

2.2.8樣品的含量測(cè)定：分別取3個(gè)批號(hào)的玄七通痹膠囊，按上述供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，每個(gè)批號(hào)平行制備2份，按確定好的色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣，每份2針，結(jié)果樣品的平均含量為344.71 μg/g。

2.2.9中間精密度試驗(yàn)：取同一樣品，由3位不同分析人員在不同日期按供試品溶液制備法操作，每人制備2份，相同條件下測(cè)定(2號(hào)柱)，每份進(jìn)2針，計(jì)算樣品含量，結(jié)果平均含量為362.50 μg/g，RSD為1.90%。

2.2.10耐用性試驗(yàn)：取樣品測(cè)定中批號(hào)為111202的同一份供試品溶液分別在1、2、3號(hào)色譜柱上測(cè)定含量(2號(hào):Hypersil C18，大連；3號(hào):YWG C18，漢邦)，每個(gè)色譜柱上進(jìn)2針，結(jié)果得平均含量為362.43 μg/g，RSD為1.39%。

3　討　論

星點(diǎn)設(shè)計(jì)是國(guó)外常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，近些年國(guó)內(nèi)也有用此法優(yōu)化處方或成型工藝的報(bào)道，但并未見(jiàn)采用此法優(yōu)選色譜條件的相關(guān)報(bào)道[4]。本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選HPLC-ELSD測(cè)定黃芪甲苷的色譜條件，保證了試驗(yàn)精度，分析了各因素之間的相互作用，并且試驗(yàn)次數(shù)也較少，在模型建立上采用非線性數(shù)學(xué)模型擬合，復(fù)合相關(guān)系數(shù)較高，預(yù)測(cè)值更接近真實(shí)值，為該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法應(yīng)用于優(yōu)選中藥含量測(cè)定的色譜條件的可行性提供了依據(jù)。根據(jù)藥材含量計(jì)算，樣品中黃芪甲苷的平均轉(zhuǎn)移率為61%，藥典規(guī)定黃芪藥材中黃芪甲苷的量不得低于0.4%，按此數(shù)據(jù)計(jì)算，玄七通痹膠囊樣品中黃芪甲苷含量應(yīng)不低于110 μg/g。

[1]左軍,張文釗,胡曉陽(yáng),等.黃芪現(xiàn)代藥理及臨床研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2014,17(1):111-112．

[2]李小玲.黃芪多糖對(duì)壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠心肌營(yíng)養(yǎng)素-1、血管緊張素Ⅱ表達(dá)的影響[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2012,41(10):1284-1287．

[3]施昶,沈詩(shī)偲,黃海飛,等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法在處方篩選和優(yōu)化中的應(yīng)用[J].機(jī)電信息,2014,32(2):41-46．

[4]何鳳蘭.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化白芍提取工藝[J].海峽藥學(xué),2014,19(8):23-25．

(收稿2015-01-22；修回2015-03-06)

Application of central composite design-response surface method for the determination of astragaloside content of Xuanqi Tongbi capsule

Jiangsu Province Xuzhou Pharmaceutical Vocational College(Xuzhou 221116)

Fu BaohuiPu Cunhai

Objective:Use central composite design-response surface method to prefer HPLC chromatographic conditions of astragaloside content from Xuanqi Tongbi capsule.Methods：Three factors were the acetonitrile,water ratio the temperature of evaporation room and the flow rate of nitrogen,to study the peak area,seperation and symmetry as indicators after overall normalization,multiple linear regression and binomial fitting with response surface method to choose the better process conditions,and predictive analysis.Results：The chromatographic conditions for the determination of astragaloside were the acetonitrile -water 33:67,evaporation room temperature was 90 ℃,the flow rate of nitrogen was 1.4 SLM.Conclusion： It shows that the optimum model is highly predictive.

Astragaloside@Central composite design-response surface method@Xuanqi Tongbi capsule

*國(guó)家科技部火炬計(jì)劃項(xiàng)目(2003EB020593)

△通訊作者：南京中山制藥有限公司(南京210012)

黃芪甲苷@星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法@玄七通痹膠囊

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.06.046