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    黃連解毒湯HPLC指紋圖譜的建立

    2015-03-22 10:47:42陳莉雯李毅民謝瑞芳
    陜西中醫(yī) 2015年2期
    關(guān)鍵詞:小檗梔子黃連

    陳莉雯 李毅民 謝瑞芳 周 昕

    上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥劑科 (上海200032)

    △通訊作者

    黃連解毒湯HPLC指紋圖譜的建立

    陳莉雯 李毅民 謝瑞芳 周 昕△

    上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥劑科 (上海200032)

    目的:建立黃連解毒湯水煎液高效液相色譜法(HPLC)指紋圖譜,為黃連解毒湯的質(zhì)控提供依據(jù)。方法:采用HPLC-DAD檢測(cè)器,XDB-C18PN990967-902色譜柱(4.6×250mm,5μm);流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為0.1%磷酸水,流速為1 mL/min,柱溫:25℃,檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm、240nm,梯度洗脫黃連解毒湯樣品。結(jié)果:建立了含有30個(gè)色譜峰的高效液相色譜圖,均得到了良好的基線分離;同時(shí)對(duì)鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、梔子苷等指標(biāo)成分進(jìn)行了含量檢測(cè)。結(jié)論:該方法簡(jiǎn)便快捷、精密度高、重現(xiàn)性好、回收率穩(wěn)定,可用于黃連解毒湯的質(zhì)量控制。

    本實(shí)驗(yàn)收集了10個(gè)批次不同產(chǎn)地、不同生產(chǎn)時(shí)間、不同廠家的黃連、黃芩、黃柏、梔子等藥材,按處方比例交叉組方后通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)建立了黃連解毒湯水煎液的HPLC指紋圖譜,并對(duì)其方法學(xué)進(jìn)行了考察,同時(shí)測(cè)定其中三大類(黃酮類、生物堿類、環(huán)烯醚萜類)7種成分(鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、梔子苷)的含量,為該方的全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

    1 儀器與材料 儀器:美國(guó)惠普公司的Agilent 1100高效液相色譜儀、上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠的XW-80A旋渦混合器、上海必能超聲儀器公司的SB2200 超聲儀、上海醫(yī)用分析儀器廠的Sartorius BS110S精密電子天平、TGL-16G 臺(tái)式高速離心機(jī)、鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司的SHB-III循環(huán)水式多用真空泵、上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠的XMT-152電熱恒溫干燥箱。

    試劑:HPLC甲醇(德國(guó)默克公司)、HPLC乙腈(德國(guó)默克公司)、磷酸(上海聯(lián)合化工廠)、所用水均為純凈水,通過(guò)Milli-Q 水處理系統(tǒng)(Millipore, Bedford, MA, USA)進(jìn)行處理。

    對(duì)照品:梔子苷(批號(hào)110749-200714),鹽酸巴馬汀(批號(hào)110732-200907),鹽酸小檗堿(批號(hào)110713-200208),黃芩苷(批號(hào)110715-200413),黃芩素(批號(hào)111595-0200905)等均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(純度>99%)。鹽酸藥根堿(批號(hào)110733-201108),漢黃芩素(批號(hào)111514-200403)等購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所(純度>99%)。

    藥材:按處方量交叉組合不同批次的黃連、黃芩、黃柏、梔子藥材,組成10個(gè)批次的黃連解毒湯(見(jiàn)表1)。

    2 方法與結(jié)果 色譜條件:采用XDB-C18 PN990967-902色譜柱(4.6×250mm,5μm);通過(guò)流動(dòng)相A為乙腈和流動(dòng)相B為0.1%磷酸水進(jìn)行梯度洗脫,具體條件如圖1所示;流速為1 mL/min;柱溫:25℃;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm(梔子苷檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm);進(jìn)樣量:5 μL;檢測(cè)時(shí)間:90 min。

    圖1 黃連解毒湯色譜條件

    對(duì)照品溶液的制備:精密稱取鹽酸小檗堿4 mg、鹽酸藥根堿0.6 mg、鹽酸巴馬汀0.8 mg、黃芩苷4.7 mg、黃芩素0.65 mg、漢黃芩素0.65 mg、梔子苷7.2 mg,將所稱取的藥品分別置于5 mL量瓶,應(yīng)用甲醇定容,并進(jìn)行不同濃度的稀釋,0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)即為對(duì)照品溶液。

    供試品溶液的制備:對(duì)組合成的10個(gè)批次黃連解毒湯分別加10倍量水進(jìn)行處理,冷浸30min,武火加熱至沸后文火保持微沸20min,注意趁熱過(guò)濾,再加水8倍量,武火加熱至沸后轉(zhuǎn)為文火微沸20min,并趁熱過(guò)濾,將2次濾液進(jìn)行合并。用10mL的量瓶分裝合煎液,每瓶各2mL,再加甲醇約至10mL,超聲提取20 min,冷卻至室溫,補(bǔ)充溶劑至刻度,搖勻,靜置過(guò)夜后,取上清液,進(jìn)行離心(10,000 轉(zhuǎn)/min)10 min,再經(jīng)過(guò)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),作為供試品溶液。

    表1 藥材產(chǎn)地及購(gòu)買(mǎi)廠家來(lái)源

    標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定:將對(duì)照品溶液精密吸取注入色譜儀,進(jìn)樣量為5 μL,測(cè)定峰面積按2.1項(xiàng)方法,以峰面積為縱坐標(biāo),對(duì)照品含量為橫坐標(biāo),制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    精密度及加樣回收率試驗(yàn):按高、中、低劑量將同一份黃連解毒湯(JQZJ3)分別加入對(duì)照品溶液,按2.3項(xiàng)下的處理得供試品溶液,連續(xù)測(cè)定3次分別于1d內(nèi)完成,以5μL為每次進(jìn)樣量,記錄峰面積,計(jì)算回收率、日間及日內(nèi)精密度。分別測(cè)定各對(duì)照品的最低檢測(cè)限(LOD)及最低定量限(LOQ)于信噪比(S/N)為3、10時(shí)。

    穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一份黃連解毒湯的供試品溶液,在0,2,4,24,48 h分別進(jìn)樣5 μL,記錄峰面積,計(jì)算RSD,考察色譜條件的穩(wěn)定性。

    重現(xiàn)性試驗(yàn):選取黃連解毒湯合煎液2 mL,按2.3項(xiàng)下藥液處理方法平行處理3份樣品,按照2.1項(xiàng)下色譜條件,進(jìn)樣5 μL,考察方法重現(xiàn)性。

    供試品測(cè)定:按照2.1.項(xiàng)下色譜條件,進(jìn)樣3 μL,檢測(cè)分析,記錄90 min色譜圖,每個(gè)供試品溶液進(jìn)樣3次,建立黃連解毒湯合煎液的HPLC指紋圖譜。

    數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):參照建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用回歸分析的方法計(jì)算樣品指標(biāo)成分的含量。

    以參照物對(duì)應(yīng)的色譜峰(s)的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積為1,各指紋峰保留時(shí)間與同一圖譜中對(duì)照峰的保留時(shí)間的比值為各指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間RRT),各指紋峰峰面積與同一圖譜中對(duì)照峰的峰面積的比值為各指紋峰的相對(duì)峰面積(RPA),計(jì)算各批藥材指紋圖譜的共有峰的RRT和RPA。

    采用國(guó)家藥典委員會(huì)開(kāi)發(fā)的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004年A版),疊加供試品的指紋圖譜。對(duì)各批次藥材及煎液運(yùn)用夾角余弦法計(jì)算相似度。根據(jù)幾何學(xué)多維空間的向量夾角制定向量余弦法,把兩個(gè)指紋當(dāng)作兩個(gè)向量,計(jì)算夾角余弦相似度,進(jìn)行相似度分析。

    圖譜情況:從供試品圖譜可以看出,在現(xiàn)有色譜條件下,7個(gè)指標(biāo)成分在280 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下均得到良好的基線分離(圖2)。而梔子苷在240 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下峰型更清晰可見(jiàn),因此,這里將黃連解毒湯在240 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下的指紋圖譜單獨(dú)列開(kāi),以更好的觀察指標(biāo)成分梔子苷(圖3)。

    檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)一共得到30個(gè)共有峰,其中3為梔子苷,15為鹽酸藥根堿,17為黃芩苷,18為鹽酸巴馬汀,19為鹽酸小檗堿,27為黃芩素,28為漢黃芩素(圖2)。

    (3:梔子苷,15:鹽酸藥根堿,17:黃芩苷,18:鹽酸巴馬汀,19:鹽酸小檗堿,27:黃芩素,28:漢黃芩素)

    圖3 黃連解毒湯傳統(tǒng)煎煮色譜圖 (240 nm)(1:梔子苷)

    方法學(xué)結(jié)果表明:各指標(biāo)成分在相應(yīng)的范圍內(nèi),均有良好的相關(guān)系數(shù)(>0.9994),線性關(guān)系良好(表2);除了黃芩素日間RSD=10.32%外,各指標(biāo)成分的日內(nèi)及日間RSD均<2.50%,肯定了本方法的精密度;定量限及最低檢測(cè)限均能滿足樣品測(cè)定的要求;梔子苷回收率為92.47%~106.86%,鹽酸小檗堿回收率為110.97%~115.14%,鹽酸藥根堿回收率為基本為112.26%~116.26%,鹽酸巴馬汀回收率為111.97%~112.65%,黃芩苷回收率為105.46%~107.69%,黃芩素回收率為87.32%~101.09%,漢黃芩素回收率為98.43%~110.14%,表明回收率良好。供試品主要指標(biāo)的成分保留時(shí)間控制在:RSD為0.05%~0.33%,相對(duì)峰面積RSD為0.18%~1.72%,由此可知該試驗(yàn)方法在48h內(nèi)基本穩(wěn)定。主要指標(biāo)成分相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<0.8%,相對(duì)峰面積的RSD在1.09%~4.83%之間,表明該方法重現(xiàn)性良好。總言之,現(xiàn)有色譜法精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率良好,可以進(jìn)行下一步分析。

    表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

    對(duì)照品回歸方程相關(guān)系數(shù)(r)線性范圍(μg)梔子苷y=1349.21x-20.740.9999660.11~7.20鹽酸巴馬汀y=1429.77x+2.550.9999330.16~1.12鹽酸藥根堿y=1485.35x+13.330.9996990.12~0.60鹽酸小檗堿y=1215.79x+18.850.9997680.12~3.20黃芩素y=2810.60x-31.250.9997130.07~0.78漢黃芩素y=4144.87x-31.020.9998530.02~0.65黃芩苷y=2445.25x-67.110.9994320.48~4.70

    指標(biāo)成分含量結(jié)果:對(duì)黃連解毒湯水煎液不同批次的成分進(jìn)行分析,結(jié)果表明(表3):不同批次的指標(biāo)成分含量具有一定差異,RSD在8.91%~45.38%之間,有的成分含量甚至可以相差數(shù)倍,如ZW17與ZW18中的黃芩苷、ZW18與ZW20中的黃芩素。

    表3 不同批次黃連解毒湯水煎液指標(biāo)成分含量(mg/g)

    相似度結(jié)果:在黃連解毒湯水煎液圖譜中,黃芩苷峰在10批合煎液中基本一致,且黃芩苷有合理的洗脫時(shí)間和已知的藥理活性,因此將黃芩苷選為參照峰。以此為對(duì)照計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明,各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%,但是相對(duì)峰面積的RSD較大,說(shuō)明藥液各批次的保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定,但各批次峰面積含量有一定差異。

    3 討 論 黃連解毒湯首載于《肘后備急方》,為清熱解毒經(jīng)典名方,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、抗真菌、抗血小板、抗氧化等藥理作用[1-4]。可以單獨(dú)或聯(lián)合其他藥物治療不穩(wěn)定型心絞痛、糖尿病、骨髓瘤、肛周膿腫以及神經(jīng)系統(tǒng)等多種疾病[6-10]。從藥物學(xué)角度來(lái)看,黃連解毒湯的理化性質(zhì)差異較大、化學(xué)成分較多、分離難度較大等,因此先前的很多研究報(bào)道都局限在整體藥效學(xué)的研究,而缺乏對(duì)其全方經(jīng)配伍組合、煎煮后的藥理變化的深入探討[11-14]。故此,本文著重研究該方煎煮后湯劑的化學(xué)特征。

    目前,指紋圖譜是一種已經(jīng)應(yīng)用成熟的分析方法,既有量的測(cè)定,又有質(zhì)的特征檢測(cè),對(duì)研究對(duì)象可作出全面、綜合地反映,較好的體現(xiàn)中藥成分的復(fù)雜性和相關(guān)性。在中醫(yī)藥現(xiàn)代化的研究中,將指紋圖譜質(zhì)量評(píng)價(jià)體系引入到相關(guān)研究的成果較少,本實(shí)驗(yàn)建立了黃連解毒湯的HPLC指紋圖譜,并采用相似度分析對(duì)指紋圖譜進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,不同批次的黃連解毒湯指紋圖譜特征、指標(biāo)成分的含量存在一定差異,這說(shuō)明產(chǎn)地、采收、加工方式、存儲(chǔ)時(shí)間和方法以及煎煮過(guò)程對(duì)湯劑的質(zhì)量均存在可能的影響。然而,如何將指紋圖譜的豐富信息綜合起來(lái)來(lái)評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量是本文不足之處,有待今后將各種化學(xué)信息、藥效信息綜合起來(lái),從而更系統(tǒng)地評(píng)價(jià)藥物質(zhì)量。

    同時(shí),從本次研究過(guò)程來(lái)看,高效液相色譜法在應(yīng)用中可以收集到藥品定性、定量的雙重信息,可以將復(fù)雜的方劑化學(xué)成分進(jìn)行個(gè)體化區(qū)分。這種點(diǎn)面結(jié)合的研究方法,是適合于中藥方劑復(fù)合型組成特點(diǎn)的。在未來(lái)的探索中,我們應(yīng)注重與方劑生產(chǎn)的實(shí)際結(jié)合,在目前中醫(yī)藥需求市場(chǎng)日益擴(kuò)大的情勢(shì)下,力圖為中醫(yī)藥現(xiàn)代化生產(chǎn)提供相應(yīng)的參考依據(jù),使科學(xué)研究成果高效的轉(zhuǎn)化為實(shí)際生產(chǎn)的方法。

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    (收稿2014- 08-15;修回2014-11-25)

    黃連解毒湯 @高效液相色譜法

    O657.7

    A

    10.3969/j.issn.1000-7369.2015.02.054

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