積雪草酸衍生物的合成與表征及其抗腫瘤活性研究

王 楠， 張 萌， 孟艷秋

(沈陽(yáng)化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110142)

積雪草酸衍生物的合成與表征及其抗腫瘤活性研究

王 楠， 張 萌， 孟艷秋

(沈陽(yáng)化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110142)

以積雪草酸為原料，對(duì)其C-2，C-3，C-23和C-28位基團(tuán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計(jì)并合成3類(lèi)共10個(gè)化合物，并經(jīng)IR、MS、1H NMR確證其結(jié)構(gòu).采用MTT法研究部分積雪草酸衍生物對(duì)人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549和人成纖維肉瘤細(xì)胞株HT-1080的體外細(xì)胞毒活性.結(jié)果顯示：化合物AA-Ⅲ2的IC50值較小，對(duì)上述3種細(xì)胞有較好的抑制作用，值得進(jìn)一步研究.

積雪草酸； 五環(huán)三萜化合物； 合成； 抗腫瘤活性

積雪草酸(2α,3β,23-三羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酸)，又名亞細(xì)亞酸(asiatic acid,AA)，屬于烏蘇烷型骨架的五環(huán)三萜類(lèi)化合物，具有廣泛的藥理活性，包括抗腫瘤[1-2]、神經(jīng)保護(hù)作用[3-4]、保護(hù)肝臟和腎臟[5-8]、抗炎[9]以及影響血管生成[10-11]等生物活性.因此，積雪草酸具有廣泛的開(kāi)發(fā)前景.為了深入研究積雪草酸的結(jié)構(gòu)與其抗腫瘤活性的關(guān)系，本文以積雪草酸為先導(dǎo)化合物，對(duì)其C-2、C-3、C-23位羥基和C-28位羧基等官能團(tuán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計(jì)并合成了3類(lèi)共10個(gè)化合物，所合成化合物均未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道.采用MTT法，對(duì)部分積雪草酸衍生物進(jìn)行體外細(xì)胞毒活性的藥理評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步研究積雪草酸的構(gòu)效關(guān)系研究奠定了基礎(chǔ).3條合成路線(xiàn)如下所示：

路線(xiàn)1 2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-羧酸(酯、胺)類(lèi)化合物合成

路線(xiàn)2N-[2-肟基-3β,23-O-異亞丙基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-氨基醇類(lèi)化合物的合成

路線(xiàn)3N-[1，2-駢噁唑-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-氨基醇類(lèi)化合物的合成

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純或化學(xué)純，使用時(shí)根據(jù)需要進(jìn)一步純化.反應(yīng)所用溶劑按常規(guī)方法加以精制.以薄層色譜(TLC)檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，薄層色譜用高效色譜硅膠GF254，柱層析色譜用200～300目柱色譜硅膠.在Buchi B-545熔點(diǎn)儀上測(cè)定化合物熔點(diǎn)，溫度未經(jīng)校正.在Thermo Nicolet 470FT紅外光譜儀上測(cè)定(KBr壓片)紅外光譜.在菲尼根hermo-finnigan LCQ equipment儀上測(cè)定質(zhì)譜.在Bruker ARX-500型核磁共振分析儀上測(cè)定核磁共振氫譜，CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo).

1.2 中間體的合成

1.2.1 2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-羧酸的制備(AA-Ⅰ)

將AA(200 mg,0.40 mmol)和對(duì)甲基苯磺酸(34 mg,0.20 mmol)，溶解在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，然后滴加2,2-二甲氧基丙烷(1.0 mL,4.0 mmol)，在室溫下攪拌，反應(yīng)完畢，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 %的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7～8，混合物用乙酸乙酯提取，有機(jī)層用蒸餾水及飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水MgSO4干燥，抽濾，減壓蒸餾得白色固體AA-1.m.p.156.4～157.8 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：3 400，1 698，1 200 cm-1.

再將硅膠負(fù)載PDC(重鉻酸吡啶钅翁,160 mg)加入到二氯甲烷中，加入0.2 mL乙酸酐攪拌30 min，而后將此溶液加到化合物AA-1的二氯甲烷溶液中，回流2 h.反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾除去硅膠，濾液減壓蒸出溶劑，再溶于30 mL乙酸乙酯，攪拌30 min，用水萃取，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥，抽濾除去干燥劑，旋蒸得到粗品.粗品經(jīng)柱層析提純后得化合物AA-2.1H NMR(500 MHz,CDCl3)，δ：5.24(s,1H,H-12),3.54(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),3.50(s,1H,H-3),3.48(d,1H,J=11.2Hz,H-23),2.40(s,1H,H-9),2.17(d,1H,J=11.2,H-18),1.25,1.15,1.13,1.04,0.98,0.75(s,each 3H),0.90(d,3H,J=6.0 Hz),0.86(d,3H,J=6.0 Hz).ESI-MS,m/z：527.4(M+H)+.

將化合物AA-2用無(wú)水乙醇溶解，按摩爾比1∶1∶1.2的比例分別加入AA-2、乙酸鈉和鹽酸羥胺，在78 ℃下回流，TLC檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn).然后蒸干溶劑，充分水洗，過(guò)濾，濾餅洗至中性，再用甲醇溶解，并加入1 mol/L的鹽酸數(shù)滴，在室溫下攪拌3 h，反應(yīng)結(jié)束后，蒸除溶劑，剩余混合物用乙酸乙酯提取，有機(jī)層用無(wú)水MgSO4干燥，抽濾，減壓蒸餾得白色固體，粗品用硅膠柱色譜純化，得產(chǎn)物AA-Ⅰ(36 mg).IR(KBr)，σ/cm-1：1 379,1 696,2 925,3 422.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：5.27(s,1H,H-12),3.52(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),3.50(s,1H,H-3),3.48(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),2.43(s,1H,H-9),2.14(d,1H,J=10.8 Hz,H-18),1.33,1.25,1.12,1.09,1.04,0.80(s,each 3H).ESI-MS,m/z：502.4(M+H)+.

1.2.2 2-肟基-3β,23-O-異亞丙基-烏蘇烷-12-烯-28-羧酸(AA-Ⅱ)的制備

將化合物AA-2用適量吡啶溶解，按摩爾比1∶2的比例分別加入化合物AA-2和鹽酸羥胺，115 ℃下回流，TLC檢測(cè).反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，再加入冰水抽濾，水洗濾餅至中性，經(jīng)柱層析分離后得固體AA-Ⅱ(48 mg).IR(KBr),σ/cm-1：1 049，1 275,1 695,2 924,3 419.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：5.27(s,1H,H-12),3.54(d,1H,J=10.8 Hz,H-23),3.51(s,1H,H-3),3.46(d,1H,J=10.8 Hz,H-23),2.42(s,1H,H-9),2.14(d,1H,J=10.6 Hz,H-18),1.35,1.33,1.13,1.06,1.04,0.98,(s,each 3H),0.92(d,3H,J=6.0 Hz),0.87(d,3H,J=6.0 Hz).ESI-MS,m/z：542.4(M+H)+.

1.2.3 1,2-駢噁唑-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-羧酸(AA-Ⅲ)的制備

將化合物AA-2用甲酸乙酯溶解，加入少量甲醇鈉，室溫下反應(yīng)24 h，用TLC跟蹤檢測(cè)確定反應(yīng)終點(diǎn).減壓蒸除溶劑，用乙酸乙酯和水萃取，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥，抽濾除去干燥劑，旋蒸.將粗品溶解在4 mL二氯甲烷中，加入少量鹽酸羥胺，室溫?cái)嚢?，用TLC跟蹤檢測(cè)確定反應(yīng)終點(diǎn).混合物用乙酸乙酯提取，有機(jī)層用蒸餾水及飽和NaCl溶液洗滌，無(wú)水MgSO4干燥，抽濾，減壓蒸餾得白色固體.然后將固體溶解在甲醇中，加入1 mol/L鹽酸數(shù)滴，攪拌3 h.減壓蒸除溶劑，用乙酸乙酯和水萃取，旋蒸后的粗品經(jīng)柱層析得產(chǎn)物AA-Ⅲ.IR(KBr),σ/cm-1：525,1 255,2 492，2 678,2 739cm-1.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：5.26(s,1H,H-12),3.62(d,1H,J=10.6 Hz,H-23),3.60(s,1H,H-3),3.46(d,1H,J=10.6 Hz,H-23),2.40(s,1H,H-9),2.20(d,1H,J=11.2 Hz,H-18),2.04(s,1H),1.29,1.16,1.14,1.09,0.96,0.88(s,each 3H).ESI-MS,m/z：512.3(M+H)+.

1.3 目標(biāo)化合物的合成

1.3.1 2-肟基-3,23-二羥基-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸酯類(lèi)化合物(AAI1～I(xiàn)3)的制備

1.3.1.1 2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-乙酯(AA-Ⅰ1)的制備

將化合物AA-Ⅰ(50 mg,0.099 8 mmol)溶解在4 mL DMF中，加入催化劑量的碳酸鉀，再滴入溴乙烷(0.028 mL,0.380 mmol)，室溫?cái)嚢?，用TLC跟蹤檢測(cè)確定反應(yīng)終點(diǎn).混合物用乙酸乙酯提取，有機(jī)層用蒸餾水及飽和氯化鈉溶液洗滌，無(wú)水MgSO4干燥，抽濾，減壓蒸餾得白色固體，粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=6/1，得白色粉末狀固體AA-Ⅰ1(22 mg).m.p.210.7～211.6 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：1 040,1 453,1 667,2 926,3 425.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：5.27(s,1H,H-12),4.30(d,1H,J=7.0 Hz,H-23),4.06(d,1H,J=7.0 Hz,H-23),3.61～3.67(m,2H,OCH2),3.50(s,1H,H-3),2.00(s,1H,NOH),1.42～1.43(t,3H,CH3),1.26,1.11,0.95,0.87,0.76,0.69(s,each 3H).ESI-MS,m/z：530.5(M+H)+.

1.3.1.2 2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-丙酯(AA-Ⅰ2)的制備

按照化合物AA-Ⅰ1的合成方法，由化合物AA-Ⅰ和溴代正丙烷反應(yīng).粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=6/1，得白色粉末狀固體AA-Ⅰ2(18 mg).IR(KBr),σ/cm-1：1 052,1 454,1 662,2 927,3 417.m.p.213.2～214.1 ℃.1H NMR(500 MHz,CDCl3)，δ：5.27(s,1H,H-12),4.28～4.32(t,2H,OCH2—),4.08(d,1H,J=8.5 Hz,H-23),3.94(d,1H,J=8.5Hz,H-23),3.33(s,1H,H-3),2.38(s,1H,H-9),2.26(d,1H,J=9.0 Hz,H-18),2.00(s,1H,NOH),1.25,1.11,0.94,0.76(s,each 3H),1.61～1.63(m,2H,—CH2—),0.95～0.96(t,3H,—CH3).ESI-MS，m/z：544.3(M+H)+.

1.3.1.3 2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-丁酯(AA-Ⅰ3)的制備

按照化合物AA-Ⅰ1的合成方法，由化合物AA-Ⅰ和溴代正丁烷反應(yīng).粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=6/1，得白色粉末狀固體AA-Ⅰ3(16 mg).IR(KBr),σ/cm-1:1 046,1 454,1 661,2 927,3 420.m.p.222.5～224.3 ℃.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：5.27(s,1H,H-12),4.08～4.16(t,2H,OCH2—),3.84(d,1H,J=10.0 Hz,H-23),3.58(d,1H,J=10.0 Hz,H-23),3.35(s,1H,H-3),2.43(d,1H,J=10.0 Hz,H-18),2.36(s,1H,H-9),1.74～1.76(m,2H,—CH2a—),1.48～1.51(m,2H,—CH2b—),1.34,1.23,1.21,0.91,0.87,0.85(s,each 3H),0.96～0.98(t,3H,—CH3).ESI-MS，m/z：573.7(M+NH3)+.

1.3.2N-2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-胺類(lèi)化合物(AAI4～I(xiàn)6)的制備

1.3.2.1N-[2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-苯胺(AA-Ⅰ4)的制備

將化合物AA-Ⅰ(50 mg，0.099 8 mmol)溶解在4 mL二氯甲烷中，加入草酰氯((COCl2)，0.4 mmol)，室溫?cái)嚢?0 h，生成2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰氯，蒸除反應(yīng)溶劑和未反應(yīng)的草酰氯，殘余物加入2 mL環(huán)己烷，減壓蒸除環(huán)己烷，反復(fù)操作2次.酰氯中加入2 mL二氯甲烷使之完全溶解后，加三乙胺調(diào)節(jié)pH為9～10，攪拌5 min后，加入苯胺(32 mg,0.4 mmol)，室溫下反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn).反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸除二氯甲烷，向反應(yīng)液中加入2 mL水，以2 mol/L鹽酸調(diào)pH至3～4，析出黃色固體，迅速減壓抽濾，水洗濾餅至中性.粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=4/1，得化合物AA-Ⅰ4(15 mg).m.p.184.0～184.9 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：1 502,1 388,1 678,2 926,3 417.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：7.43(d,2H,2CHa),7.19(d,1H,CHb),7.23(s,1H,NH),5.27(s,1H,H-12),3.76(d,1H,J=7.0 Hz,H-23),3.21(s,1H,H-3),3.40(d,1H,J=7.0 Hz,H-23),2.40(s,1H,H-9),2.17(d,1H,J=11.2 Hz,H-18),1.25,1.15,1.13,1.04,0.98,0.75(s,each 3H).ESI-MS,m/z：574.0(M+H)+.

1.3.2.2N-[2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-環(huán)己胺(AA-Ⅰ5)的制備

按照化合物AA-Ⅰ4的合成方法，由化合物AA-Ⅰ和環(huán)己胺制備而成.粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=4/1，得黃色固體AA-Ⅰ5(13 mg).m.p.182.5～183.4 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：602,1 040,1 637,2 924,3 445.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：5.27(s,1H,H-12),3.76(d,1H,J=7.0 Hz,H-23),3.14(s,1H,H-3),3.40(d,1H,J=7.0 Hz,H-23),2.40(s,1H,H-9),2.17(d,1H,J=11.2 Hz,H-18),1.25,1.18,1.13,0.96,0.89,0.88(s,each 3H).ESI-MS,m/z：568.8(M+H)+.

1.3.2.3N-[2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-芐胺(AA-Ⅰ6)的制備

按照化合物AA-Ⅰ4的合成方法，由化合物AA-Ⅰ和芐胺制備而成.粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=3/1，得黃色固體AA-Ⅰ6(14 mg).m.p.185.7～186.8 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：1 025,1 454,1 651,2 927,3 282.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：7.33(m,2H,2CHb),7.23～7.26(m,3H,CHa),5.27(s,1H,H-12),3.54(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),3.50(s,1H,H-3),3.48(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),2.40(s,1H,H-9),2.17(d,1H,J=11.2 Hz,H-18),1.32,1.14,1.11,1.04,0.99,0.84(s,each 3H).ESI-MS,m/z：591.4(M+H)+.

1.3.3 2-肟基-3β,23-O-異亞丙基-烏蘇烷-12-烯-28-氨基醇類(lèi)化合物的(AAⅡ1～Ⅱ2)制備

1.3.3.1N-[2-肟基-3β,23-O-異亞丙基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-3-氨基-1-丙醇(AA-Ⅱ1)的制備

將化合物AA-Ⅱ(50 mg,0.092 4 mmol)溶解在4 mL二氯甲烷中，加入草酰氯(0.4 mmol)，室溫?cái)嚢?0 h，生成2-肟基-3β,23-O-異亞丙基-烏蘇烷-12-烯-28-酰氯，蒸除反應(yīng)溶劑和未反應(yīng)的草酰氯，殘余物加入2 mL環(huán)己烷，減壓蒸除環(huán)己烷，反復(fù)操作2次.酰氯中加入2 mL二氯甲烷使之完全溶解后，加三乙胺調(diào)pH為9～10，攪拌5 min后，加入3-氨基-1-丙醇(30 mg,0.4 mmol)，室溫下反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn).反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸除二氯甲烷，向反應(yīng)液中加入2 mL水，以2 mol/L鹽酸調(diào)pH至3～4，析出白色固體，迅速減壓抽濾，水洗濾餅至中性.室溫干燥得粗品，經(jīng)硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=4/1，得白色粉末狀固體AA-Ⅱ1(19 mg).m.p.234.3～235.2 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：1 064,1 655,1 726，2 937,3 420.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：8.04(s,1H,NH),5.27(s,1H,H-12),3.83～3.86(m,1H,NCH),3.77(d,1H,J=9.6 Hz,H-23),3.50(s,1H,H-3),3.34(d,1H,J=9.6 Hz,H-23),3.25(d,2H,J=9.2 Hz,CH2O),2.23(d,1H,J=11.0 Hz,H-18),1.32(d,3H,J=8.4 Hz,CH3),1.25,1.15,1.13,1.04,0.98,0.75(s,each 3H),0.92(d,3H,J=6.4 Hz),0.87(d,3H,J=6.4 Hz),0.92(d,3H,J=6.0 Hz),0.87(d,3H,J=6.0 Hz).ESI-MS,m/z：598.4(M+H)+.

1.3.3.2N-[2-肟基-3β,23-O-異亞丙基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-2-氨基-2-甲基乙醇(AA-Ⅱ2)的制備

按照化合物AA-Ⅱ1的合成方法，由化合物AA-Ⅱ和2-氨基-1-丙醇制備而成.粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=3/1，得白色固體AA-Ⅱ2(18 mg).m.p.230.5～232.1 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：1 064,1 655,1 726，2 937,3 420.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：8.03(s,1H,NH),5.27(s,1H,H-12),3.24～3.26(t,1H,NCH2),3.77(d,1H,J=9.6 Hz,H-23),3.50(s,1H,H-3),3.34(d,1H,J=9.6 Hz,H-23),3.50(t,2H,CH2O),3.25(d,2H,J=9.2 Hz,CH2O),2.23(d,1H,J=11.0 Hz,H-18),1.58(m,2H,—CH2—),1.22,1.15,1.11,1.04,0.98,0.78(s,each 3H),1.14(d,3H,J=5.7 Hz),0.92(d,3H,J=6.3 Hz).ESI-MS,m/z：598.3(M+H)+.

1.3.4N-[1,2-駢噁唑-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-氨基醇乙酸酯類(lèi)化合物(AAⅢ1～Ⅲ2)的制備

1.3.4.1N-[1,2-駢噁唑-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-3-氨基-1-丙醇乙酸酯(AA-Ⅲ1)的制備

將化合物AA-Ⅲ(100 mg,0.092 4 mmol)溶解在4 mL二氯甲烷中，加入草酰氯(0.4 mmol)，室溫?cái)嚢?0 h，蒸除反應(yīng)溶劑和未反應(yīng)的草酰氯，殘余物加入2 mL環(huán)己烷，減壓蒸除環(huán)己烷，反復(fù)操作2次.酰氯中加入2 mL二氯甲烷使之完全溶解后，加三乙胺調(diào)pH為9～10，攪拌5 min后，加入3-氨基-1-丙醇(30 mg,0.4 mol/L)，室溫下反應(yīng)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)終點(diǎn).反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸除二氯甲烷，向反應(yīng)液中加入2 mL水，以2 mol/L鹽酸調(diào)pH至3～4，析出淡黃色固體，迅速減壓抽濾，水洗濾餅至中性.室溫干燥得粗品淡黃色固體AA-4.

將經(jīng)過(guò)硅膠柱提純的固體AA-4溶于二氯甲烷中，加入乙酸酐及少量DMAP(二甲氨基吡啶)，室溫下攪拌，反應(yīng)完畢，蒸出溶劑，加入3 mL水分散固體，以2 mol/L鹽酸調(diào)pH至3～4，抽濾，水洗至中性，室溫干燥得淡黃色粉末狀固體AA-Ⅲ1(13 mg).m.p.213.6～214.7 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：1 036,1 724,2 928,3 872.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：8.11(s,1H,NH),7.83(s,1H,N==CH),5.27(s,1H,H-12),3.54(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),3.50(s,1H,H-3),3.48(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),3.12～3.20(t,2H,NCH2),2.40(s,1H,H-9),2.22(s,3H,CH3),2.17(d,1H,J=11.2 Hz,H-18),1.25,1.15,1.13,1.04,0.98,0.75(s,each 3H).ESI-MS，m/z：629.0(M+H2O)+.

1.3.4.2N-[1,2-駢噁唑-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-2-氨基-2-甲基乙醇乙酸酯(AA-Ⅲ2)的制備

按照化合物AA-Ⅲ1的合成方法，由化合物AA-Ⅲ和2-氨基-1-丙醇制備而成.粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=3/1，得淡黃色粉末狀固體AA-Ⅲ2(14 mg).m.p.214.1～214.9 ℃.IR(KBr)，σ/cm-1：1 140,1 455,1 758,2 928,3 422 .1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：7.83(s,1H,N==CH),5.27(s,1H,H-12),4.49～4.51(t,2H,CH2O),3.52(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),3.50(s,1H,H-3),3.44(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),2.40(s,1H,H-9),2.24(s,3H,CH3),2.17(d,1H,J=11.2 Hz,H-18),1.25,1.15,1.13,1.04,0.98,0.75(s,each 3H).ESI-MS,m/z：629.4(M+H2O)+.

1.4 初步體外細(xì)胞毒活性測(cè)試

選用人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549和人成纖維肉瘤細(xì)胞株HT-1080為靶細(xì)胞，采用四唑鹽比色法即MTT法，對(duì)化合物AA、AA-Ⅰ1、AA-Ⅰ5和AA-Ⅲ2進(jìn)行體外細(xì)胞毒活性測(cè)試.

1.4.1 埋板

將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化、離心，制成細(xì)胞懸液，吹勻并將SGC-7901、A549、HT-1080三種細(xì)胞其密度分別調(diào)至2×104個(gè)/mL、2.5×104個(gè)/mL、1×104個(gè)/mL，以180 μL/孔接種到96孔板中，加的過(guò)程中不斷吹勻細(xì)胞，保證細(xì)胞密度一致，鋪板過(guò)程要迅速，保證每孔的細(xì)胞數(shù)目大致相同，將96孔板置于37 ℃、含5 %的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h.

1.4.2 加藥

將藥物配制成以完全培養(yǎng)基為溶劑，初始質(zhì)量濃度為1 g/L的溶液，將上述溶液稀釋成5個(gè)劑量組，藥物的質(zhì)量濃度分別為500,50, 5，0.5，0.05 mg/L.取各個(gè)劑量的藥液加入96孔板中，每孔20 μL，每劑量3個(gè)復(fù)孔.加藥后的藥物終濃度分別為50，5，0.5，0.05，0.005 mg/L.加藥完畢放入培養(yǎng)箱中孵育72 h.

1.4.3 MTT檢測(cè)

將加藥并于培養(yǎng)箱中孵育48 h后的96孔板中培養(yǎng)基輕輕甩出，然后加入配置好的MTT溶液(5 g/L)，每孔20 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h.取出孵育3 h的96孔板，將其中的MTT溶液輕輕甩出，每孔加100 μL的DMSO，微量振蕩儀上振蕩5 min以使甲瓚完全溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm下測(cè)光密度(OD)值，并記錄數(shù)據(jù).按下列公式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞體外增殖的抑制率(Inhibition Rate，IR)：

用IC50計(jì)算軟件來(lái)計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50).

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)合成

以積雪草酸為起始原料，合成了2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-羧酸(酯、胺)類(lèi)、N-[2-肟基-3β,23-O-異亞丙基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-氨基醇類(lèi)和N-[1,2-駢噁唑-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-氨基醇乙酸酯類(lèi)3類(lèi)共10個(gè)化合物，均未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，其結(jié)構(gòu)通過(guò)IR、MS和1H NHR得以確認(rèn).

2.2 生物活性評(píng)價(jià)

采用四唑鹽比色法即MTT法對(duì)化合物的抗腫瘤活性進(jìn)行篩選.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和表2.由表1、表2數(shù)據(jù)可知：積雪草酸衍生物對(duì)三種腫瘤細(xì)胞有一定抑制作用.其中化合物AA-Ⅲ2在50 mg/L質(zhì)量濃度中，對(duì)于SGC-7901、HT-1080、A549的抑制率分別為93.06 %，96.85 %，95.52 %，明顯優(yōu)于對(duì)照品吉非替尼(73.25 %，85.01 %，68.15 %)，與阿霉素的抑制活性基本相同，甚至對(duì)于A549腫瘤細(xì)胞抑制作用要強(qiáng)于阿霉素(90.25 %).而化合物AA-Ⅰ1，AA-Ⅰ5在50 mg/L質(zhì)量濃度中，對(duì)于SGC-7901、HT-1080、A549的抑制率相對(duì)較低，具有較弱的抑制活性.化合物AA-Ⅲ2(IC50：12.395 μmol/L,13.293 μmol/L)對(duì)SGC-7901、HT-1080的細(xì)胞毒性與吉非替尼(10.527 μmol/L,12.998 μmol/L)相當(dāng)，其中對(duì)A549(8.052 μmol/L)的細(xì)胞毒性明顯優(yōu)于吉非替尼(23.496 μmol/L)，并且AA-Ⅲ2和AA相比，對(duì)于A549、HT-1080兩種腫瘤細(xì)胞有著明顯的優(yōu)勢(shì).

表1 化合物在不同質(zhì)量濃度下對(duì)三種細(xì)胞株的抑制率

表2 化合物的IC50值

3 結(jié) 論

初步的構(gòu)效關(guān)系表明：28位成氨基醇乙酸酯對(duì)SGC-7901、A549、HT-1080三種腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性明顯增強(qiáng)，如AA-Ⅲ2≈阿霉素>>吉非替尼，甚至對(duì)于A549抑制作用要略高于阿霉素；28位成酯的衍生物，對(duì)SGC-7901、A549、HT-1080三種腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性要高于28位成酰胺的衍生物，如AA-Ⅰ1>AA-Ⅰ5；1位成肟可能對(duì)積雪草酸對(duì)SGC-7901、A549、HT-1080三種腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性起到了抑制作用，如AA>> AA-Ⅰ1>AA-Ⅰ5，而1,2位駢成噁唑環(huán)可能對(duì)積雪草酸的抗腫瘤尤其是對(duì)A549細(xì)胞起到了促進(jìn)作用，如AA-Ⅲ2>>AA.

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Synthesis and Characterization of Asiatic Acid Derivatives and Its Anti-tumor Activities

WANG Nan, ZHANG Meng, MENG Yan-qiu

(Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142, China)

Natural active product is an important source of anti-cancer drugs.Through C-2,C-3,C-23 and C-28 for structural modification,three types of ten new compounds of asiatic acid derivatives were designed and synthesized.The target compounds were not reported,and confirmed its structure by IR,MS,1H NMR.Anti-tumor activities of asiatic acid and these derivatives against SGC-7901,A549 and HT-1080 cells in vitro were investigated by MTT assay.The results indicated that compound AA-III2had stronger cell growth inhibitor than other products.It is worth to be intensively further studies.

asiatic acid; pentacyclic triterpenoid; synthesis; anti-tumor activity

2014-02-27

王楠(1987-)，女，遼寧沈陽(yáng)人，碩士研究生在讀，國(guó)家獎(jiǎng)學(xué)金獲得者，主要從事五環(huán)三萜類(lèi)天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)改造及其抗癌活性的研究.

孟艷秋(1963-)，女，遼寧義縣人，教授，博士，主要從事天然化合物有效成分結(jié)構(gòu)改造及抗癌活性和新型半合成抗生素方面的研究.

2095-2198(2015)03-0242-07

10.3969/j.issn.2095-2198.2015.03.011

R914.5

A