糖尿病腎病動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

李 懿，張立穎

糖尿病腎?。―N）是糖尿病慢性微血管并發(fā)癥之一，以腎小球血管損傷、硬化為主，形成結(jié)節(jié)性病變，進(jìn)而出現(xiàn)腎功能異常，最終形成終末期腎病（ESRD）。在西方國(guó)家人群中，DN已經(jīng)成為終末期腎衰竭的主要原因，也是糖尿病致死的主要原因［1］。隨著糖尿病的不斷流行，我國(guó)DN的發(fā)病率也呈增多趨勢(shì)，DN防治已經(jīng)成為一個(gè)不容忽視的問(wèn)題。但由于確切的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，建立合適的模型是研究其發(fā)病機(jī)制、病理變化的重要線(xiàn)索。同時(shí)也為臨床防治該疾病提供依據(jù)。目前，DN動(dòng)物模型的常見(jiàn)制備方法包括手術(shù)切除胰腺、化學(xué)藥物誘導(dǎo)、自發(fā)性形成、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等，但由于手術(shù)切除胰腺后的動(dòng)物常在還未出現(xiàn)并發(fā)癥時(shí)就死于糖尿病本身，所以本研究主要對(duì)后面幾種方法進(jìn)行闡述。

1 誘發(fā)性DN動(dòng)物模型

通過(guò)各種技術(shù)手段損傷動(dòng)物的胰臟或胰島B細(xì)胞導(dǎo)致胰島素缺乏，或用各種拮抗劑對(duì)抗胰島素的作用，引起實(shí)驗(yàn)性糖尿病或高血糖，而持續(xù)性高血糖是發(fā)生DN的必要條件。

1.1 1 型糖尿病腎病模型制備 DN 動(dòng)物模型的誘發(fā)藥物包括鏈脲佐菌素（STZ）、四氧嘧啶（ALX）、鏈脲佐菌素聯(lián)合弗氏完全佐劑以及四氧嘧啶加嘌呤霉素等。常用的是STZ、ALX。STZ通過(guò)選擇性殺傷動(dòng)物胰島B細(xì)胞，使其喪失分泌功能，形成不可逆的胰島素依賴(lài)性糖尿病，隨病程的延長(zhǎng)可發(fā)展為DN［2］。采用STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病模型動(dòng)物，可出現(xiàn)中等程度的蛋白尿、血肌酐升高和與DN相關(guān)的病理改變。由于STZ造模穩(wěn)定、快速，種屬選擇性不強(qiáng)，復(fù)制前不需禁食，組織毒性較小等，故常用STZ誘導(dǎo)構(gòu)建1型糖尿病小鼠模型，技術(shù)已基本成熟，得到了廣泛應(yīng)用［3］。

1.1.1 高劑量STZ誘導(dǎo)的小鼠糖尿病腎病模型 一次性給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物≥200mg/kg的STZ腹腔注射，增大胰島B細(xì)胞毒性，導(dǎo)致糖尿病發(fā)生率增高和嚴(yán)重程度加劇。由于嚴(yán)重的高血糖，需要對(duì)血糖濃度和胰島素給藥情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。幾個(gè)月后，可以檢測(cè)到中等程度蛋白尿和腎小球硬化。但是，由于STZ對(duì)其他組織也有非特異性毒性作用，因此很難將STZ直接毒性作用與高血糖病變加以區(qū)分。一些研究表明，該模型中蛋白尿嚴(yán)重程度與STZ劑量有關(guān)，而不依賴(lài)于血糖水平［4］。此外，高劑量STZ引起小鼠急性腎損傷已有報(bào)道［5］。

1.1.2 低劑量STZ誘導(dǎo)的小鼠糖尿病腎病模型 為了減輕STZ非特異性細(xì)胞毒性，人們采用低劑量（40 mg/kg～55mg/kg）STZ多次注射誘導(dǎo)糖尿病。該方法一般是40mg/kg～50mg/kg STZ腹腔注射，每天1次，連續(xù)5d［6，7］。低劑量STZ多次注射可導(dǎo)致胰腺B細(xì)胞低程度地反復(fù)損傷，同時(shí)伴有胰島內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。以更小劑量STZ，如30mg/kg多次腹腔注射誘導(dǎo)的動(dòng)物模型被認(rèn)為同1型糖尿病更接近［8］。Gurley等［9］報(bào)道小鼠品系對(duì)低劑量STZ多次誘導(dǎo)的糖尿病易感性順序?yàn)镈BA＞C57BL/6＞MRL/MP＞129/SvEv＞BALB/c。研究也表明，雄性小鼠較雌性小鼠對(duì)STZ更敏感。不同近交系小鼠對(duì)低劑量STZ的B細(xì)胞毒性和非特異性毒性作用的敏感性存在很大差異，造模時(shí)可調(diào)整劑量。一般情況下，對(duì)同一品系，采用適當(dāng)?shù)牡蛣┝縎TZ多次誘導(dǎo)與高劑量STZ一次誘導(dǎo)可產(chǎn)生相似的高血糖，但蛋白尿的程度一般較低［10］，可能反映了直接腎毒性降低。美國(guó)糖尿病并發(fā)癥動(dòng)物模型協(xié)會(huì)（AMDCC）還建議采用一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的低劑量模型誘導(dǎo)糖尿病并發(fā)癥包括DN。根據(jù)這一建議，作為DN動(dòng)物模型的小鼠應(yīng)該連續(xù)5d，每天腹腔注射STZ 50mg/kg，然而僅有50%C57BL/6小鼠發(fā)展為顯性糖尿病。因此，該方法是否被相關(guān)專(zhuān)家采納還值得商榷。

1.1.3 STZ誘導(dǎo)的大鼠DN模型 大鼠DN模型一般在斯?jié)娎赘瘛ざ嗬祝⊿parague Dawley，SD）、威斯塔·京都（Wistar Kyoto，WKY）和自發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneous Hypertension Rat，SHR）大鼠中誘導(dǎo)。8周齡雄性大鼠（200g～250g）禁食16h，一次性尾靜脈注射（SD 55mg/kg，WKY 60mg/kg，SHR 45mg/kg）飲用蔗糖水（15g/L）48h［11］，以減少早期死亡（因?yàn)橘A存的胰島素從受損的胰島中大量釋放導(dǎo)致低血糖）。注射后1周，測(cè)定空腹血糖15mmol/L以上者（約有90%）納入DN研究。為防止隨后發(fā)生酮尿，糖尿病大鼠每天需皮下注射長(zhǎng)效胰島素（2U/鼠～4U/鼠）以維持理想的血糖水平（16mmol/L～33mmol/L）。STZ注射后至少3周，腎臟才能從STZ輕微的急性腎毒性中恢復(fù)過(guò)來(lái)，這時(shí)才能開(kāi)始檢查STZ誘發(fā)DN的作用［12］。42d后大鼠尿微量白蛋白水平升高，腎臟膜細(xì)胞增生、基質(zhì)增多、腎小球基底膜增厚。

1.1.4 單側(cè)腎切除后誘導(dǎo)的大鼠DN模型 不同品系的大鼠（SD，Wistar和SHR）單側(cè)腎臟切除術(shù)加上35mg/kg～50mg/kg STZ多次小劑量誘導(dǎo)即可制備模型。單側(cè)腎切除后可導(dǎo)致對(duì)側(cè)腎的代償性肥大并加速疾病的進(jìn)展過(guò)程。

1.2 2型糖尿病腎病模型

1.2.1 大鼠2型糖尿病腎病模型 采用SD大鼠喂以高糖高脂飼料（飼料組成：10.0%豬油、20.0%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%常規(guī)飼料），以誘導(dǎo)出胰島素抵抗。聯(lián)合40mg/kg的STZ腹腔注射［13］破壞胰島B細(xì)胞的部分功能，使胰島素分泌減少，形成非胰島素依賴(lài)性2型糖尿病。此方法模擬人類(lèi)2型糖尿病形成過(guò)程，后期形成DN模型。21d后血糖穩(wěn)定升高，98d后模型大鼠出現(xiàn)與臨床DN相似的生化、尿液、病理組織學(xué)、免疫組織化學(xué)變化［14］。

1.2.2 小鼠2型糖尿病腎病模型 給C57BL/6小鼠喂飼高脂飼料（10.0%豬油、20.0%蔗糖、2.5%膽固醇、1.0%膽酸鹽、66.5%常規(guī)飼料）是誘導(dǎo)肥胖和胰島素抵抗2型糖尿病的一種常用方法。該法對(duì)研究動(dòng)脈硬化尤其有用。高脂飼料的作用與研究的小鼠品系有關(guān)，APJ小鼠相對(duì)抵抗［15］，該模型中蛋白尿未有報(bào)道。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)高脂飼料可在KK－ay小鼠誘導(dǎo)明顯的蛋白尿［16］。

2 自發(fā)性DN動(dòng)物模型

該模型是指動(dòng)物未經(jīng)過(guò)任何有意識(shí)的人工處置，在自然情況下發(fā)生的DN，或者由于基因突變，染色體畸變，通過(guò)定向培育保留下來(lái)的動(dòng)物模型，進(jìn)而發(fā)生DN。這類(lèi)動(dòng)物模型特點(diǎn)是來(lái)源有限，繁殖飼養(yǎng)條件要求高，發(fā)病率低，造模周期較長(zhǎng)，價(jià)格昂貴，但在一定程度上減少了人為的因素，腎臟病變特點(diǎn)與人類(lèi)DN相似程度較高，此類(lèi)動(dòng)物模型為糖尿病及其并發(fā)癥機(jī)制及藥效學(xué)研究提供了實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

2.1 1型糖尿病腎病自發(fā)性動(dòng)物模型

2.1.1 NOD（nonobese diabetic mouse）小鼠 NOD小鼠是目前研究最廣泛的1型糖尿病腎病自發(fā)性動(dòng)物模型。由于與人類(lèi)DN的致病性和遺傳的相似性，該模型廣泛用于對(duì)病因、病理和疾病相似性的探討。NOD小鼠是ICR近交系小鼠，大概在4周齡～5周齡起，小鼠胰腺自發(fā)出現(xiàn)程度不等的炎癥，24周齡～30周齡時(shí)大多數(shù)胰腺B細(xì)胞被破壞出現(xiàn)顯性糖尿病，進(jìn)而發(fā)展成為DN，表現(xiàn)為尿蛋白排泄增加。腎臟病理變化：系膜細(xì)胞增生，腎小球毛細(xì)血管基底膜增厚，細(xì)胞外基質(zhì)增多，最后出現(xiàn)腎小球硬化［17］。在NOD小鼠中，雌鼠的發(fā)病率比雄鼠高4倍［4］。該模型與人類(lèi)1型糖尿病在臨床癥狀上有眾多相似之處：高血糖、尿糖、多尿、多飲，不僅有如此相似之處，還包括含有特異性主要組織相容性復(fù)合體（MHC）ò類(lèi)等位基因和許多非MHC位點(diǎn)作為多基因易感性位點(diǎn)；通過(guò)造血干細(xì)胞傳播疾?。灰葝u內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（胰腺炎）；有胰島自身抗體；對(duì)T細(xì)胞嚴(yán)重依賴(lài)［18］。然而它對(duì)酮癥酸中毒的抵抗性更強(qiáng)。如果沒(méi)有胰島素的注射，NOD小鼠通常死于脫水而非酮癥酸中毒。盡管如此，NOD小鼠仍然不是一個(gè)完美的動(dòng)物模型，作為一個(gè)近交系，存在著可以發(fā)展為1型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)并且以一種可以預(yù)見(jiàn)的方式發(fā)展［19］。而人類(lèi)的1型糖尿病腎病是一個(gè)多基因遺傳病，并且受到環(huán)境的影響。

2.1.2 胰島素－2Akita小鼠 因?yàn)镮nsulin－2基因突變，導(dǎo)致胰島素肽鏈錯(cuò)誤折疊，選擇性地對(duì)胰島B細(xì)胞產(chǎn)生蛋白毒性，導(dǎo)致B細(xì)胞分泌胰島素能力下降。突變的雜合子在（3～4）周齡時(shí)由于嚴(yán)重的胰島素缺乏表現(xiàn)為顯著的高血糖，但純合子通常在圍生期死亡。雄性小鼠比雌性小鼠更缺乏胰島素。Akita小鼠表現(xiàn)出一定程度的蛋白尿和輕至中度的腎小球系膜擴(kuò)張。DN早期即可表現(xiàn)為足細(xì)胞缺失，可能與足細(xì)胞凋亡增加有關(guān)［20］。Akita小鼠模型可以出現(xiàn)病理結(jié)構(gòu)表現(xiàn)，如腎小球系膜擴(kuò)張，足細(xì)胞數(shù)目減少，腎小球硬化，腎間質(zhì)纖維化等［21］。此外，Akita小鼠可產(chǎn)生不明原因的IgA系膜沉積，這就使得關(guān)于腎小球系膜增生的解釋變得更加復(fù)雜［22］。目前，這種突變的小鼠種系中只有C57BL/6可以利用，但C57BL/6小鼠對(duì)DN有較好的耐受性，因此不是理想的DN模型。

2.2 2型糖尿病腎病自發(fā)模型

2.2.1 db/db小鼠 db/db小鼠是位于小鼠4號(hào)染色體的瘦素受體因突變所致的先天肥胖性2型糖尿病模型。db/db小鼠發(fā)生糖尿病的病程與人類(lèi)極為相似，微血管并發(fā)癥多見(jiàn)，尤其好發(fā)DN。在出生10d后就表現(xiàn)出高胰島素血癥，1個(gè)月后表現(xiàn)出輕度的血糖升高，8周齡后表現(xiàn)為顯著的高血糖［10］。12周～14周出現(xiàn)明顯的組織形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為腎小球肥大，系膜區(qū)增寬，基底膜增厚，細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)量積聚，腎功能明顯損害［23］。在db/db小鼠中蛋白尿水平為68μg/24h～600μg/24h［10，24－27］。一般來(lái)說(shuō)，這些小鼠不會(huì)發(fā)展到腎小球膜溶解、結(jié)節(jié)性腎小球硬化和進(jìn)行性腎功能不全［28］。對(duì)于人類(lèi)早期的DN研究而言，不失為一個(gè)好的選擇。

2.2.2 GK大鼠 GK大鼠是由對(duì)葡萄糖不耐受的Wistar大鼠重復(fù)近親繁殖多代后產(chǎn)生。這種動(dòng)物模型的特點(diǎn)是中度的高血糖，外周胰島素抵抗和肥胖表型。GK大鼠產(chǎn)生2型糖尿病腎病主要由于胰島B細(xì)胞受損。GK大鼠表現(xiàn)出與人類(lèi)早期DN一致的腎小球肥大、基底膜增厚等。在出生8個(gè)月后也不表現(xiàn)出明顯的蛋白尿和進(jìn)行性腎病。然而，Sato等［29］發(fā)現(xiàn)GK大鼠在24月齡時(shí)表現(xiàn)出節(jié)段性腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化等晚期腎臟病變。與此同時(shí)，出現(xiàn)了顯著的蛋白尿。因此，他們認(rèn)為晚期DN大鼠的腎臟變化與人類(lèi)進(jìn)行性DN相似，GK大鼠可以作為研究DN及2型糖尿病的有用工具。

2.2.3 OLETF大鼠 OLEFTF大鼠是膽囊收縮素（CCK）2A受體信使RNA（mRNA）的表達(dá)完全缺失的2型糖尿病大鼠。早期以胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂為主，以后逐漸出現(xiàn)胰腺功能減退，胰島纖維化，晚期合并DN［30］?？梢圆扇″憻捄拖拗聘邿崃匡嬍车臄z入作為OLEFT大鼠在2型糖尿病腎病的進(jìn)展過(guò)程中的預(yù)防措施。12周齡～20周齡時(shí)表現(xiàn)出輕度的肥胖和高胰島素血癥，18周齡時(shí)表現(xiàn)出與晚發(fā)性高血糖［31］，22周齡時(shí)出現(xiàn)大量顯性蛋白尿、30周齡時(shí)、OLETF大鼠腎臟膜基質(zhì)增生，基底膜增厚，腎小球透明性變、縮小，出現(xiàn)結(jié)節(jié)性腎小球硬化［32］，54周齡時(shí)表現(xiàn)出與人類(lèi)DN相類(lèi)似的大量蛋白尿、結(jié)節(jié)性病變、彌漫性腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化［33］。因此，OLEFT被視為研究DN最好的鼠類(lèi)動(dòng)物模型之一。

2.2.4 ob/ob小鼠 ob/ob小鼠糖尿病的發(fā)生是由于ob基因突變，造成其編碼的蛋白瘦素缺乏，引起肝脂肪生成和肝糖原異生顯著增加，高血糖又刺激胰島素分泌，導(dǎo)致胰島素抵抗。這種突變主要存在于DBA2/J和B57BL/6J品系小鼠。ob/ob小鼠癥狀的輕重取決于遺傳背景，純合子動(dòng)物表現(xiàn)為肥胖、明顯的高血糖及高胰島素血癥，而ob/ob/6J小鼠胰島素水平可達(dá)正常小鼠10倍～50倍，但其血糖常只有輕度的升高。Clee等［34］將ob/ob變異引入到BTBR小鼠品系中。BTBRob/ob小鼠在第8周出現(xiàn)與人類(lèi)DN早期形態(tài)學(xué)特征類(lèi)似的早期腎臟改變，包括早期足細(xì)胞喪失及同時(shí)出現(xiàn)的蛋白尿。蛋白尿出現(xiàn)10周后可檢測(cè)到系膜增厚，第18周時(shí)這些小鼠出現(xiàn)DN晚期的典型特征，如嚴(yán)重的系膜增厚、腎小球系膜溶解、持續(xù)性足細(xì)胞丟失、基底膜增厚、輕度間質(zhì)纖維化。BTBRob/ob小鼠的一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)是在相對(duì)較短時(shí)間就會(huì)發(fā)展到DN晚期，這就縮短了模型建立后對(duì)DN晚期進(jìn)行干預(yù)的研究時(shí)間［35］。ob/ob小鼠與db/db小鼠比較，腎臟疾病更少，這可能是由于ob/ob小鼠缺乏循環(huán)的瘦素，而瘦素可以直接刺激間質(zhì)產(chǎn)生。另外一種可能是兩種小鼠的基因背景不同。Pichaiwong等［36］利用瘦素替代而不抑制腎素血管緊張素系統(tǒng)（RAAS），發(fā)現(xiàn)晚期DN動(dòng)物模型的結(jié)構(gòu)（腎小球系膜擴(kuò)張、腎小球膜溶解、基底膜增厚、足細(xì)胞的損失）和功能（活性氧的積累、蛋白尿）幾乎可以完全逆轉(zhuǎn)，因此，BTBRob/ob小鼠提供了一個(gè)先進(jìn)但可逆的動(dòng)物模型，這些結(jié)果也表明了足細(xì)胞的恢復(fù)是可能的但不是由RAAS抑制引起的，可能解釋了RAAS抑制劑在治療DN上緩解的有限性，這一動(dòng)物模型的缺點(diǎn)是價(jià)格昂貴，不能生育。

2.2.5 Zucker大鼠 Zucker大鼠體內(nèi)編碼瘦素受體的基因錯(cuò)義突變，表現(xiàn)出高血糖、高血脂、高血壓。27周齡大鼠腎臟出現(xiàn)腎小球囊膜基質(zhì)彌散或結(jié)節(jié)狀的增生，基底膜增厚，近曲小管萎縮。Reisin等［37］采用Zucker大鼠高脂喂養(yǎng)的方法制作模型，大鼠體內(nèi)蓄積大量膽固醇、脂肪酸，在體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，引起腎臟細(xì)胞凋亡和器官損壞。

3 基因工程糖尿病腎病動(dòng)物模型

基因工程動(dòng)物是指某種或某些遺傳性狀通過(guò)基因工程技術(shù)而被人為改造過(guò)的動(dòng)物。利用轉(zhuǎn)基因、基因敲除、基因替換等手段，可以用來(lái)研究DN相關(guān)遺傳易感基因。通過(guò)這一技術(shù)，我們可以在動(dòng)物基因組的特定位點(diǎn)引入所設(shè)計(jì)的突變基因，模擬造成人類(lèi)遺傳性疾病的基因結(jié)構(gòu)或數(shù)量異常；可以通過(guò)對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，在動(dòng)物發(fā)生、發(fā)育的全過(guò)程中研究體內(nèi)基因的功能及其結(jié)構(gòu)功能之間的關(guān)系。

3.1 eNOS敲除鼠 敲除上皮一氧化氮合酶（endothelial nitric oxidesynthase，eNOS）基因的 C57BLKS/J（BKS）db/db小鼠，表現(xiàn)為高血糖、高血壓、蛋白尿。26周后其病理改變?yōu)槟I小球系膜基質(zhì)擴(kuò)張、伴小動(dòng)脈瘤的腎小球系膜溶解及Kimmelstiel－Wilson結(jié)節(jié)性改變。eNOS可以減少內(nèi)皮細(xì)胞間連接，降低血管通透性，不含eNOS基因的小鼠更易形成DN損傷。eNOS基因敲除鼠在模擬糖尿病的晚期腎臟形態(tài)學(xué)變化，尤其是在有敏感的遺傳背景小鼠是在很多糖尿病動(dòng)物模型中很難見(jiàn)到，這意味著這種小鼠模型非常具有發(fā)展前景?；蛟S當(dāng)這種突變被轉(zhuǎn)移到另外一種遺傳背景上時(shí)和eNOS解剖位點(diǎn)的缺失可調(diào)節(jié)時(shí)一個(gè)更穩(wěn)定的糖尿病動(dòng)物模型可能會(huì)出現(xiàn)［35］。

3.2 轉(zhuǎn)基因OVE26小鼠 利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使鈣調(diào)蛋白在OVE26自發(fā)性糖尿病小鼠胰島B細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)。小鼠2月齡時(shí)出現(xiàn)蛋白尿，6月齡時(shí)出現(xiàn)大量蛋白尿，9月齡時(shí)腎小球基底膜增厚，系膜擴(kuò)張，出現(xiàn)腎小球硬化和小管間質(zhì)性纖維化等病理改變，伴有腎小球?yàn)V過(guò)率降低［38］。

3.3 GIPR（dn）轉(zhuǎn)基因小鼠 GIPR（dn）轉(zhuǎn)基因小鼠是一種新型的早發(fā)性DN動(dòng)物模型，病理現(xiàn)象與人類(lèi)DN相似。通過(guò)隨機(jī)誘變和基因修飾獲得，使得葡萄糖依賴(lài)性促胰島素多肽受體隱形表達(dá)，破壞B細(xì)胞，胰島素分泌減少，形成DN。進(jìn)而發(fā)展成為ESRD，這種小鼠對(duì)于單基因DN的發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究具有重要意義［39，40］。

4 小結(jié)

隨著DN發(fā)生率的逐漸升高，建立一個(gè)理想的動(dòng)物模型刻不容緩。但是，人類(lèi)DN是一個(gè)發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜的并發(fā)癥。由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的差異性，動(dòng)物模型僅僅能模擬人類(lèi)DN的病理學(xué)改變和部分功能性改變，不能完全重現(xiàn)人類(lèi)DN。因此，DN動(dòng)物模型的制備應(yīng)該更加側(cè)重于病因上的相似性，今后應(yīng)該不斷探索，努力開(kāi)發(fā)出更多更好的DN動(dòng)物模型用于醫(yī)學(xué)研究中。

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