結(jié)核分枝桿菌L型檢測(cè)對(duì)比噬菌體D29在結(jié)核病診斷和治療的價(jià)值

陳武松，邱其武，韓琴麗，鐘衛(wèi)衛(wèi)

(荊門市第一人民醫(yī)院感染科，湖北荊門 448000)

結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人民健康的慢性傳染病，由結(jié)核分枝桿菌(MTB)導(dǎo)致。結(jié)核分枝桿菌L型(MTB-L)是結(jié)核分枝桿菌變異所產(chǎn)生，可在體內(nèi)長(zhǎng)期潛伏，導(dǎo)致結(jié)核病緩慢發(fā)展、惡化、復(fù)發(fā)以及耐藥［1]。有研究結(jié)果表示，確診肺結(jié)核患者中，MTB-L的陽(yáng)性檢測(cè)率可達(dá)45%［2];在耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)患者中，MTB-L陽(yáng)性率約為50%［3]。本文選取活動(dòng)性和非活動(dòng)性結(jié)核病患者痰液，進(jìn)行MTB-L檢測(cè)，比較MTB-L檢測(cè)常用方法和噬菌體D29的表達(dá)?，F(xiàn)將結(jié)果總結(jié)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料

1．1．1 研究對(duì)象選擇 選取2013年1月—2014年12月期間，我院收治的活動(dòng)性結(jié)核病患者206例，其中男167例，女39例，年齡19～74歲，平均年齡(43．0±2．8)歲。根據(jù)臨床癥狀、細(xì)菌學(xué)和放射學(xué)診斷，均已確診為活動(dòng)性結(jié)核病。其中，初治患者126例，復(fù)治患者80例;細(xì)菌培養(yǎng)顯陽(yáng)性的痰標(biāo)本，根據(jù)其對(duì)利福平和異煙肼的藥敏實(shí)驗(yàn)［4]顯示，藥敏患者46例，單藥耐藥患者105例，其中多藥耐藥患者84例。選取同時(shí)期于院進(jìn)行治療的非活動(dòng)性結(jié)核病患者160例，其中男103 例，女57例，年齡20～71歲，平均(41．0±3．2)歲。診斷依據(jù)為:(1)無結(jié)核變態(tài)反應(yīng)引起的過敏反應(yīng);(2)結(jié)核菌素(PPD-C5TU)皮膚試驗(yàn)＜5 mm;(3)痰抗酸染色涂片6次及以上均呈陰性，痰MTB培養(yǎng)呈陰性;(4)X線胸片及CT顯示纖維條索和硬結(jié)，動(dòng)態(tài)觀察病灶無變化。

1．1．2 標(biāo)本的留取 留取共30 mL放入無菌的塑料小瓶中。

1．2 方法 留取所有病例的清晨咳痰標(biāo)本(用力咳出深部痰)，分別用以下四種方法對(duì)MTB-L進(jìn)行檢測(cè)。比較各種方法的靈敏度和特異度;同時(shí)，比較噬菌體D29生物擴(kuò)增法在不同類型肺結(jié)核病患者中，對(duì)MTB-L的檢測(cè)情況。

1．2．1 改良痰IK抗酸染色涂片法 按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》要求，將痰液涂抹在玻片上，加苯酚品紅液和鹽酸乙醇進(jìn)行脫色，再加亞甲藍(lán)進(jìn)行復(fù)染。玻片干燥后進(jìn)行鏡檢。

1．2．2 BACTEC MGIT960快速培養(yǎng)法 痰標(biāo)本按照儀器使用說明進(jìn)行處理，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，BACTEC MGIT960熒光強(qiáng)度記憶探測(cè)器每60 min連續(xù)測(cè)定培養(yǎng)管內(nèi)熒光強(qiáng)度，判斷管內(nèi)分枝桿菌生長(zhǎng)情況。

1．2．3 結(jié)核分枝桿菌L型培養(yǎng)法 無菌條件下，取痰進(jìn)行處理后，接種于92-3TB-L液體培養(yǎng)基，在37℃下培養(yǎng)1～2周后，觀察結(jié)果。

1．2．4 噬菌體D29生物擴(kuò)增法(PhaB法) 按試劑盒說明書操作。痰標(biāo)本消化處理后，加入噬菌體D29，37℃孵育60 min后加入殺病毒劑，再加入細(xì)胞試劑和瓊脂液，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，18～24 h后判讀結(jié)果。

1．3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS19．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組定性數(shù)據(jù)間的比較采用χ2檢驗(yàn)，認(rèn)為P＜0．05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;多組間的兩兩比較采用修正P值法，三組和一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的比較，認(rèn)為P＜0．05/3=0．0167具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 活動(dòng)性結(jié)核患者痰標(biāo)本的MTB-L檢測(cè)結(jié)果比較 從表1看出，噬菌體D29生物擴(kuò)增法的檢測(cè)靈敏度均高于其他三種方法，與改良痰IK抗酸染色涂片法(χ2=7．432，P=0．0136 ＜ 0．0167)、BACTEC MGIT960 快速培養(yǎng)法(χ2=13．686，P=0．002 ＜0．0167)具有顯著性差異;與結(jié)核分枝桿菌 L 型培養(yǎng)法(χ2=1．288，P=0．185 ＞0．0167)的差異不顯著。在特異度上，以結(jié)核分歧桿菌L型培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，噬菌體D29生物擴(kuò)增法的特異度較之略低，為92．08%(χ2=1．066，P=0．109 ＞0．0167)，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他兩種方法的檢測(cè)特異度較之更低，改良痰IK抗酸染色涂片法為 78．54%(χ2=9．589，P=0．0123 ＜ 0．0167)，BACTEC MGIT960 快速培養(yǎng)法為86．58%(χ2=8．753，P=0．0103 ＜0．0167)且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 痰標(biāo)本的MTB-L檢測(cè)結(jié)果比較

2．2 活動(dòng)性結(jié)核病患者和非活動(dòng)性結(jié)核病患者的MTB-L檢測(cè)結(jié)果 采用噬菌體D29生物擴(kuò)增法檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病患者和非活動(dòng)型結(jié)核患者的MTB-L，通過對(duì)照結(jié)核分歧桿菌L型培養(yǎng)結(jié)果來確定MTB-L的檢測(cè)陽(yáng)性情況，結(jié)果如表2所示?；顒?dòng)性結(jié)核病患者的MTB-L陽(yáng)性檢測(cè)率(57．3%)顯著高于非活動(dòng)性結(jié)核病患者(26．9%)，兩組結(jié)果經(jīng)χ2檢驗(yàn)后，認(rèn)為差異具有顯著性(χ2=6．184，P=0．033)。

表2 活動(dòng)性結(jié)核病患者和非活動(dòng)性結(jié)核病患者M(jìn)TB-L檢測(cè)結(jié)果

2．3 活動(dòng)性結(jié)核病初治、復(fù)治患者的MTB-L檢測(cè)結(jié)果

如表3所示，采用噬菌體D29生物擴(kuò)增法檢測(cè)和結(jié)核分歧桿菌L型培養(yǎng)驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性結(jié)核病復(fù)治患者的MTBL陽(yáng)性率(78．8%)顯著高于初治患者(51．6%)，兩組結(jié)果經(jīng)χ2檢驗(yàn)后，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3．252，P=0．042 ＜0．05)。

表3 活動(dòng)性結(jié)核病初治、復(fù)治患者的MTB-L檢測(cè)結(jié)果

2．4 藥敏感性不同患者的MTB-L檢測(cè)結(jié)果 如表4所示，采用噬菌體D29生物擴(kuò)增法檢測(cè)，并通過結(jié)核分歧桿菌L型培養(yǎng)驗(yàn)證后，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性結(jié)核病患者中，對(duì)利福平或異煙肼耐藥的患者的MTB-L陽(yáng)性率(83．8%)顯著高于藥敏患者(39．6%)，兩組結(jié)果經(jīng)χ2檢驗(yàn)后，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13．748，P=0．001 ＜0．0167)。耐藥患者中，顯示同時(shí)對(duì)利福平和異煙肼耐藥的多藥耐藥患者的MTB-L陽(yáng)性率高達(dá)90%以上。

表4 藥敏感性不同患者的MTB-L檢測(cè)結(jié)果

3 討論

結(jié)核分枝桿菌L型(MTB-L)，由于缺乏細(xì)胞壁或細(xì)胞壁不完整，導(dǎo)致細(xì)胞壁上分枝菌酸和磷脂缺乏，經(jīng)抗酸染色后多為顯示為陰性;此外，MBL-T菌體內(nèi)滲透壓高，普通培養(yǎng)基等滲透的條件下，菌體容易溶解破壞，導(dǎo)致用普通結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢測(cè)，結(jié)果常為陰性，且臨床表現(xiàn)不典型。MTB-L也是導(dǎo)致結(jié)核病患者耐藥的主要原因之一。因此，對(duì)MTB-L進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)和有效的控制，是對(duì)結(jié)核病進(jìn)行診療的重要手段。1951年，Gardner和Weiser第一次分離獲得分枝桿菌噬菌體，并相繼發(fā)現(xiàn)了對(duì)結(jié)核分枝桿菌有裂解作用的分枝桿菌噬菌體D29，噬菌體D29對(duì)結(jié)核分枝桿菌具有裂解作用［5]。噬菌體D29作為一種新型的結(jié)核病診斷和治療載體，越來越受到結(jié)核病研究領(lǐng)域的關(guān)注。

本研究運(yùn)用三種常見的MTB-L檢測(cè)方法，對(duì)比噬菌體D29生物擴(kuò)增法，首先對(duì)活動(dòng)性結(jié)核患者進(jìn)行了MTB-L檢測(cè)。結(jié)果表明MTB-L陽(yáng)性檢出率顯著高出改良痰IK抗酸染色涂片法和BACTEC MGIT960快速培養(yǎng)法，且四種方法的靈敏度(54．4%，49．5%，57．3%，67．5%)均高于以往文獻(xiàn)報(bào)道的42．4% ～ 45%［2，6]，這可能因?yàn)榛顒?dòng)性結(jié)核患者有一半(106/206)為耐藥患者。此外，以MTB-L培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)比較其他三種方法的特異度，結(jié)果顯示噬菌體生物擴(kuò)增法顯示出與MTB-L培養(yǎng)法較一致的特異度，而其他兩種方法的特異度顯著低于MTB-L培養(yǎng)法，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在獲得檢測(cè)結(jié)果的時(shí)間上，噬菌體D29生物擴(kuò)增法為48 h內(nèi)［7]，慢于改良痰IK抗酸染色涂片法［8]，但快于BACTEC MGIT960快速培養(yǎng)法［9]和MTB-L法，同時(shí)，噬菌體D29生物擴(kuò)增法有試劑盒對(duì)檢測(cè)操作進(jìn)行規(guī)范［10]，且噬菌體 D29 保存方便［11]，更適合在臨床上對(duì)MTB-L進(jìn)行準(zhǔn)確而快速的檢驗(yàn)。

本文采用噬菌體D29生物擴(kuò)增法檢測(cè)和MTB-L培養(yǎng)法驗(yàn)證的方法，分別對(duì)我院106例活動(dòng)性結(jié)核病初治患者和80例活動(dòng)性結(jié)核病復(fù)治患者進(jìn)行MTB-L檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)復(fù)治患者的MTB-L陽(yáng)性率(78．8%)均顯著高于初治患者(51．6%)，P ＜0．05。黃燊德等［12]在對(duì)296例病例進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MTB-L陽(yáng)性患者復(fù)治或復(fù)發(fā)率為20．0%(7/35)，認(rèn)為MTB-L與結(jié)核病復(fù)發(fā)、惡化存在一定關(guān)系。結(jié)合MTB-L在非活動(dòng)性結(jié)核患者中的檢出率，我們認(rèn)為在臨床診斷上，MTB-L檢測(cè)陽(yáng)性也應(yīng)視作結(jié)核病有活動(dòng)性，MTB-L是結(jié)核分枝桿菌在感染的宿主體內(nèi)持續(xù)存在的一種類型，是造成結(jié)核病復(fù)發(fā)的根源。

［1] 趙 丹．結(jié)核分枝桿菌L型檢測(cè)對(duì)結(jié)核病診療價(jià)值的研究［D]．廣州:南方醫(yī)科大學(xué)，2013．

［2] 張雪麗，梅早仙，吳 琦．結(jié)核分歧桿菌L型細(xì)菌的研究進(jìn)展［J]．國(guó)際呼吸雜志，2013，33(18):1425 －1428．

［3] 楊小猛，趙 丹，陳倩瑜，等．結(jié)核分枝桿菌L型感染對(duì)結(jié)核病患者耐藥狀況的影響［J]．臨床肺科雜志，2015，20(3):426－429．

［4] 丁秀秀，譚守勇，譚耀駒，等．噬菌體法檢測(cè)利福平耐藥在耐多藥肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值［J]．實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28(24):4088－4090．

［5] 高健齊，廖云君，傅冰川．小鼠超聲霧化吸入結(jié)核分枝桿菌噬菌體D29生物安全性的初步研究［J]．醫(yī)學(xué)綜述，2010，16(15):2397－2399．

［6] 吳風(fēng)霞，李慧靈，王鑫君．結(jié)核分枝桿菌L型檢測(cè)的臨床意義［J]．中國(guó)防癆雜志，2014，29(2):107 －109．

［7] 李志媛，馮 爽，張 立，等．噬菌體法快速檢測(cè)痰中結(jié)核分枝桿菌的臨床應(yīng)用［J]．天津醫(yī)藥，2010，38(1):68－69．

［8] 趙 丹，陳倩瑜，江雄飛，等．改良痰結(jié)核分枝桿菌L型涂片檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用［J]．熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2012，12(2):175－177．

［9] Zhao D，Yang X，Chen Qet al．A modified acid － fast staining method for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis［J]．Journal of MicrobiologicalMethods，2012，91:128 －132．

［10]彭 麗，沈小兵，羅永艾，等．結(jié)核分枝桿菌噬菌體試劑盒的研制與初步評(píng)價(jià)［J]．重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，35(3):389－392．

［11]鄔亭亭，劉 平，羅永艾，等．分枝桿菌噬菌體D29的生物學(xué)特性研究及其抗耐藥結(jié)核潛力的探討［J]．世界科技研究與發(fā)展，2012，34(2):314 －317．

［12]黃燊德，黃鳳賢，湯志強(qiáng)．結(jié)核分枝桿菌L型與肺結(jié)核復(fù)發(fā)的研究［J]．實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26(6):977 －978．