TBX2和MDM2在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性

郭真理，陳 柯，徐 傲，杜 軍，沈 倩

(安徽省立醫(yī)院南區(qū)病理科，安徽合肥 230001)

原癌基因的異常激活在子宮內(nèi)膜樣腺癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用。生理情況下原癌基因編碼的蛋白質(zhì)對正常細(xì)胞的生長與分化起正性調(diào)控作用，各種致癌因素的作用會使正常細(xì)胞內(nèi)處于正?；蛴邢薇磉_(dá)的原癌基因被激活為有致癌活性的癌基因。相關(guān)癌基因TBX2與MDM2相互協(xié)同調(diào)控結(jié)腸腺癌及乳腺癌等腺癌發(fā)生發(fā)展已有一些研究，而同時檢測二者在子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性報道不多，我們運用免疫組化SP法檢測TBX2與MDM2蛋白在92例子宮內(nèi)膜樣腺癌中的表達(dá)情況，初步探討其表達(dá)變化在腫瘤發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的作用及對腫瘤靶點尋求及預(yù)后判斷的意義。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本來源及處理 選取安徽省立醫(yī)院本部及南區(qū)病理科2001年9月—2012年10月經(jīng)中性甲醛固定及石蠟包埋的子宮內(nèi)膜樣腺癌標(biāo)本92例，患者年齡38～72歲，平均55歲，依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2000年的標(biāo)準(zhǔn)對子宮內(nèi)膜樣腺癌進(jìn)行手術(shù)病理分期:Ⅰ期者35例，Ⅱ期者30例，Ⅲ期者27例;其中病理分級為G1級(高分化)者35例，G2級(中分化)者40例，G3級(低分化)者17例;肌層浸潤為≤1/2者45例，＞1/2者47例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為發(fā)生者27例，未發(fā)生者65例。同時選取因其它緣故如診斷性刮宮或子宮肌瘤實行手術(shù)的子宮病患存檔蠟塊標(biāo)本，其中子宮內(nèi)膜正常增生期30例，單純性增生30例，復(fù)雜伴不典型性增生30例，所有標(biāo)本均經(jīng)兩名具有高級職稱的病理專家復(fù)核診斷，所有病患術(shù)前均未進(jìn)行放化療或激素類內(nèi)分泌治療。

1．2 組織芯片制備 首先復(fù)查HE切片選取富集腫瘤細(xì)胞的區(qū)域，其次標(biāo)記上述選定區(qū)域?qū)?yīng)的蠟塊位點，再次用組織芯片儀制作空心蠟?zāi)?，最后用組織芯片取樣器在蠟塊標(biāo)記位點取出目標(biāo)組織并放入空心蠟?zāi)Ｖ?，?gòu)建8×7點陣的組織微陣列。對組織芯片蠟塊行3μm厚連續(xù)切片，并裱褙于購自北京中杉金橋生物公司的陽離子防脫片上行相關(guān)染色。

1．3 主要試劑與方法 即用型MDM2鼠抗人單克隆抗體(ZM－0425)及通用型二步法試劑盒(PV－6000)均購自北京中杉金橋生物公司;濃縮型TBX2鼠抗人單克隆抗體由北京中杉公司代購，工作液濃度為1∶100。方法采用SP法:切片經(jīng)二甲苯、梯度酒精脫蠟至水，檸檬酸鹽高壓加熱修復(fù)抗原，3%過氧化氫阻斷，其余步驟按說明書依次進(jìn)行。用既往TBX2與MDM2陽性切片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1．4 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 以細(xì)胞核和(或)細(xì)胞漿出現(xiàn)黃色、棕黃色及棕褐色為陽性，與背景顏色一樣或無著色為陰性。結(jié)果選用半定量積分法［1]判讀:首先依陽性細(xì)胞在視野中占百分比評分:陰性為0，陽性細(xì)胞≤10%為1分，11% ～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分;其次依染色強度評分:無色為0，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，同時考慮背景著色。兩項得分之積:陰性(－)為0～4分，弱陽性(1+)為4～5分，中陽性(2+)為6～8分，強陽性(3+)為9～12分。

1．5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件分析，率的比較采用χ2檢驗，F(xiàn)isher's精確概率法用于判斷樣本差異的顯著性，TBX2與MDM2蛋白之間的相關(guān)性用Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2．1 TBX2和MDM2在良惡性病變子宮內(nèi)膜中表達(dá) 見表1。TBX2與MDM2蛋白在正常增生期內(nèi)膜多呈陰性表達(dá)(圖1，圖2);TBX2蛋白主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞質(zhì)，少量胞核表達(dá)(圖3);MDM2陽性表達(dá)主要位于子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞核(圖4)。從子宮內(nèi)膜正常增生期到子宮內(nèi)膜樣腺癌，TBX2和MDM2的陽性表達(dá)率漸次升高。χ2檢驗顯示子宮內(nèi)膜樣腺癌中TBX2陽性表達(dá)率(76．1%)顯著高于正常增生期內(nèi)膜及單純性增生內(nèi)膜(30．0%;36．7%)，亦顯著高于復(fù)雜伴不典型增生內(nèi)膜(43．3%)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)。而復(fù)雜伴不典型增生組織相較正常增生期內(nèi)膜表達(dá)差異沒有顯著性(P＞0．05);χ2檢驗顯示子宮內(nèi)膜樣腺癌中MDM2蛋白表達(dá)與正常增生期內(nèi)膜、單純性增生及復(fù)雜不典型性增生內(nèi)膜組間差異有顯著性(P均＜0．01)，復(fù)雜伴不典型性增生與正常增生期內(nèi)膜差異亦有顯著性(P＜0．01)，與單純性增生內(nèi)膜差異沒有顯著性(P ＞0．05)。

表1 TBX2和MDM2在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

2．2 TBX2和MDM2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

見表2。TBX2陽性表達(dá)與子宮內(nèi)膜樣腺癌病理學(xué)分級高低、肌層浸潤深淺及臨床分期高低均有關(guān)(χ2=11．143，P ＜0．01;χ2=9．306，P ＜0．01;χ2=8．276，P ＜0．05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否無關(guān)(χ2=3．442，P ＞0．05);MDM2陽性表達(dá)率與子宮內(nèi)膜樣腺癌病理學(xué)分級高低、肌層浸潤深淺無關(guān)，與臨床分期高低、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否也不具相關(guān)性(χ2=1．964，χ2=2．081，χ2=3．867，χ2=1．377，P 均 ＞0．05)。

表2 子宮內(nèi)膜樣腺癌中TBX2和MDM2的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2．3 TBX2和MDM2表達(dá)的相關(guān)性 Spearman等級相關(guān)分析顯示子宮內(nèi)膜樣腺癌中TBX2與MDM2蛋白表達(dá)呈正向相關(guān)性(rs=0．346，P ＜0．01)。

圖1 TBX2蛋白在正常增生期內(nèi)膜中的表達(dá)呈陰性

圖3 TBX2蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌中主要表達(dá)于細(xì)胞漿，少量胞核表達(dá)

圖4 MDM2蛋白在子宮內(nèi)膜樣腺癌中主要表達(dá)于細(xì)胞核，均為SP法，高倍放大

圖2 MDM2蛋白在正常增生期內(nèi)膜中的表達(dá)呈陰性

3 討論

TBX2是T－BOX基因家族重要組員，TBOX區(qū)為其特有的結(jié)構(gòu)，在生物體內(nèi)主要有調(diào)控發(fā)育的作用，屬發(fā)育調(diào)控相關(guān)基因。其編碼蛋白主要通過羧基末端的抑制轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)域發(fā)揮阻遏作用。TBX2廣泛表達(dá)于各種組織的胚胎發(fā)育過程，能夠指導(dǎo)胚胎以及組織器官軸向發(fā)育［2－3]。TBX2可由多條途徑參與腫瘤的形成過程，首先，P19ARF－MDM2－P53通路是體內(nèi)與細(xì)胞衰老有關(guān)的重要作用軸，而TBX2可通過抑制P19ARF的表達(dá)封閉細(xì)胞衰老途徑，抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生，當(dāng)TBX2的異常累積到一定程度會導(dǎo)致細(xì)胞的惡性變［4]。其次，與 myc、sis等經(jīng)典癌基因協(xié)同作用，使細(xì)胞過度增殖惡化［5]。再次，可以與P21基因啟動子區(qū)結(jié)合抑制P21基因的表達(dá)并使其在DNA損傷后不能發(fā)揮誘導(dǎo)作用［6]。此外，新近研究［7]還發(fā)現(xiàn)TBX2能夠干擾抑癌基因PRb的轉(zhuǎn)錄從而使其對細(xì)胞周期進(jìn)程失去控制能力。研究表明TBX2蛋白在多種人類惡性腫瘤如胰腺癌、乳腺癌等中均呈高表達(dá)［8－9]。本實驗發(fā)現(xiàn)92例子宮內(nèi)膜樣腺癌中TBX2陽性表達(dá)率(76．1%，70/92)顯著高于30例正常增生期內(nèi)膜及30例單純性增生內(nèi)膜(30．0%，9/30;36．7%，11/30)，亦顯著高于復(fù)雜伴不典型增生內(nèi)膜(43．3%，13/30)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．01)。而相較正常增生期內(nèi)膜而言，在復(fù)雜伴不典型增生組織中表達(dá)雖有上升勢頭，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。這與本課題組之前［10]做72例子宮內(nèi)膜樣腺癌標(biāo)本的研究結(jié)果一致，樣本量的擴(kuò)大仍然支持上述結(jié)果，增加了可信度。而且與其他學(xué)者［11]的研究結(jié)果也基本吻合。可以看出，TBX2陽性表達(dá)率在子宮內(nèi)膜病變前期(單純性增生及復(fù)雜伴不典型增生階段)與正常增生期內(nèi)膜差別不大，而到了病變后期(腺癌發(fā)生階段)其表達(dá)率卻發(fā)生陡然升高，提示TBX2基因活化主要發(fā)生在子宮內(nèi)膜病變晚期。本次還發(fā)現(xiàn)TBX2陽性率隨著病理學(xué)分級的變低及肌層浸潤的加深而增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均＜0．01)，即低分化的癌變組織中高表達(dá)，高分化的癌變組織中低表達(dá);肌層深浸潤的腫瘤組織中表達(dá)更強，肌層淺浸潤的腫瘤組織中表達(dá)相對弱些。這可能與TBX2抑制P19ARF從而阻遏細(xì)胞衰老抑或干擾PRb轉(zhuǎn)錄使細(xì)胞周期和分化不能正常進(jìn)行有關(guān)。另外TBX2表達(dá)情況與臨床分期之間的差異亦有顯著性(P＜0．01)，即高分期的病人TBX2表達(dá)較高，低分期的患者表達(dá)稍弱。而臨床分期是臨床上判斷病患預(yù)后情況的重要參考指標(biāo)，臨床分期的增高往往預(yù)示著病人情況不理想，發(fā)生遠(yuǎn)處多部位轉(zhuǎn)移可能性較大，預(yù)后較差。上述結(jié)果提示TBX2陽性高表達(dá)使癌組織易于突破基底膜向肌層及更遠(yuǎn)處浸潤性生長，提升了癌組織侵襲能力，促進(jìn)了子宮內(nèi)膜樣腺癌向增殖更快、惡性程度更高方向演進(jìn)。故而TBX2基因具有癌基因顯著特征，與腫瘤的浸潤侵襲密切相關(guān)，為腫瘤的預(yù)后評估與生物治療提供了新的關(guān)鍵因子。

MDM2是一種進(jìn)化保守基因，位于人染色體12q13－14，在體內(nèi)作為一種轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，可以自發(fā)誘導(dǎo)癌變形成，正常人體多個組織器官均可見其表達(dá)。MDM2處于P19ARF－MDM2－P53作用軸的核心，在體內(nèi)其主要和野生型P53(wtP53)之間通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)進(jìn)行相互作用［12]，也就是說，wtP53可以促進(jìn)MDM2的轉(zhuǎn)錄，使MDM2蛋白表達(dá)變高;同時過表達(dá)的MDM2蛋白又可與wtP53結(jié)合在一起發(fā)揮降低其轉(zhuǎn)錄活性的作用，阻遏了wtP53基因的轉(zhuǎn)錄激活功能，并使wtP53蛋白表達(dá)水平維持在低水平。除了wtP53以外，MDM2還可抑制被wtP53活化的下游基因P21的抑制細(xì)胞增生作用。另外MDM2還能夠通過增強Rb相關(guān)的E2F－I聚合物的加快生長作用等非wtP53依賴方式調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡［13]。本次實驗我們加大樣本量發(fā)現(xiàn)MDM2陽性表達(dá)率在30例正常增生期內(nèi)膜中顯著低于92例子宮內(nèi)膜樣腺癌(P＜0．01)，在30例復(fù)雜不典型增生中亦明顯低于92例子宮內(nèi)膜樣腺癌(P＜0．01)。并且在30例子宮內(nèi)膜正常增生期組織中亦顯著低于30復(fù)雜不典型性增生內(nèi)膜(P ＜0．01)，這與我們之前［14]癌變組織較少時的研究一致，提示高表達(dá)的MDM2蛋白在子宮內(nèi)膜病變剛開始時就已經(jīng)存在，MDM2基因異常激活在腫瘤進(jìn)程中屬于早期事件。另本研究還發(fā)現(xiàn)MDM2陽性表達(dá)率隨著子宮內(nèi)膜樣腺癌病理學(xué)分級的降低及肌層浸潤加深發(fā)生有增高勢頭，臨床分期較高者表達(dá)亦高于較低者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生者相較未發(fā)生轉(zhuǎn)移者表達(dá)亦相對高些，但統(tǒng)計學(xué)上均無意義。另外有學(xué)者［15]研究子宮內(nèi)膜樣腺癌亦發(fā)現(xiàn)MDM2陽性表達(dá)率與病理學(xué)分級的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與腫瘤臨床分期、肌層浸潤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。綜上說明MDM2基因活化始發(fā)于子宮內(nèi)膜組織病變早期，在促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞從正常增生狀態(tài)變成不典型增生，從不典型增生到高分化癌變中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。單從本實驗看，其在腫瘤后期惡化演進(jìn)發(fā)展中的作用不是太明顯，但并不代表其高表達(dá)不可進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤侵襲，因為我們的實驗只做了蛋白層次，而且還可能有誤差的存在，故而需要進(jìn)一步加深研究。

本次我們在92例子宮內(nèi)膜樣腺癌標(biāo)本中研究TBX2與 MDM2蛋白的表達(dá)關(guān)系，得出 TBX2與MDM2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。與宋一村等［16]在45例子宮內(nèi)膜樣腺癌標(biāo)本中的研究相符合。另外二者其在結(jié)腸腺癌和乳腺癌［17－18]等腺癌中的研究也是正向相關(guān)。提示兩者在腫瘤特別是腺癌演進(jìn)中起協(xié)同作用，其聯(lián)系可能是TBX2通過阻遏P19ARF蛋白表達(dá)促進(jìn)MDM2較強表達(dá)，亦有可能是內(nèi)在結(jié)構(gòu)有配套作用位點甚或其他相關(guān)途徑。我們目前只用了免疫組化方法，具體機制還搞不清，需要進(jìn)一步加深實驗研究。不管機理如何，有一點是可以肯定的，即TBX2與MDM2在腺癌中起著癌基因的作用，當(dāng)某些致癌因素有效活化它們后，可使級聯(lián)反應(yīng)的相關(guān)蛋白激活，引起正常細(xì)胞過度增殖后惡變聚積形成腫瘤。同時加速腫瘤侵襲和進(jìn)展，子宮內(nèi)膜樣腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程接受多種基因調(diào)控，尤其在向肌層浸潤時，當(dāng)TBX2與MDM2都高表達(dá)形成合力，對肌層具有極強的破壞性?？傊?，TBX2與MDM2蛋白都高表達(dá)可提示腫瘤惡性程度較高和預(yù)后不佳，至于其能不能作為有用的生物標(biāo)記分子或是基因治療靶點，可能還需要更多的研究。

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