氧化應(yīng)激在 TRAIL誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡中的作用

葉記林，于有江，吳愛(ài)蓮，王冬燕，彭建明，劉永春，劉延慶

(1．揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009;2．江蘇省蘇北人民醫(yī)院兒科，江蘇 揚(yáng)州 225000;3．揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225001)

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是一種具有良好前景的治療腫瘤的藥物，它能選擇性誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常組織無(wú)明顯損傷。但較高濃度的TRAIL對(duì)人體正常細(xì)胞也有損傷，多種腫瘤細(xì)胞株對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡并不敏感等問(wèn)題阻礙了 TRAIL的應(yīng)用［1]。弄清TRAIL誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制是突破點(diǎn)。近年來(lái)，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)證明，TRAIL誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激密切相關(guān)［2－3]。然而TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的氧化應(yīng)激作用的具體機(jī)制研究很少，現(xiàn)以Hela細(xì)胞為模型探討TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的氧化應(yīng)激作用，為臨床腫瘤治療提供參考。我們以往的實(shí)驗(yàn)證實(shí)TRAIL誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡中線粒體途徑發(fā)揮了重要作用［6]，本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步探討氧化應(yīng)激作用與線粒體途徑的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 材料 人宮頸癌 Hela細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物庫(kù)。Human TRAIL蛋白購(gòu)于 Millipore公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司，小牛血清購(gòu)于杭州四季青公司，MTT和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于Amresco公司，N－乙酰半胱氨酸(NAC)購(gòu)于Calbiochem公司，GSH、MDA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，Bcl-2、Cyt C、DR 4、DR 5 抗體購(gòu)自Cell Signal公司，MRC－1024型激光共聚焦儀和流式細(xì)胞儀為美國(guó)BIO－RAD公司產(chǎn)品。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞用含10% 小牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，在 37℃，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。設(shè)生理鹽水對(duì)照組、TRAIL組(終濃度為40μg·L－1)、抗氧化劑 NAC 組(終濃度為10 mmol·L－1)、TRAIL+NAC組(先用10 mmol·L－1NAC預(yù)處理細(xì)胞2 h，然后加入 TRAIL)。當(dāng)細(xì)胞處理時(shí)，換含2%小牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1．2．2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增值的抑制 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2×105/孔細(xì)胞接種于24孔板。分組處理細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。藥物作用后每孔加入0．5 g·L－1MTT 300 μL，孵育 4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入 DMSO 500μL，振蕩10 min，完全顯色后，轉(zhuǎn)移至96孔板，用酶標(biāo)儀在570/630 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度OD值(OD值代表相對(duì)活細(xì)胞數(shù))。

1．2．3 分光光度比色法分析 GSH、MDA含量的變化 分組處理細(xì)胞，將收集的細(xì)胞用預(yù)冷的 PBS(pH 7．2)重懸，超聲破碎細(xì)胞制成勻漿液，4℃ 離心，取上清液，采用分光光度比色法檢測(cè)細(xì)胞勻漿液總蛋白含量，GSH、MDA含量檢測(cè)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1．2．4 流式細(xì)胞儀測(cè)定胞內(nèi)活性氧水平 參照文獻(xiàn)［7]方法，細(xì)胞用10μ mol·L－1DCFH-DA 在 37℃ 孵育45 min，然后分組加藥處理細(xì)胞。細(xì)胞孵育后用PBS漂洗，用流式細(xì)胞儀以488 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，530 nm為發(fā)射波長(zhǎng)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光強(qiáng)度。每份樣品記10 000個(gè)細(xì)胞。

1．2．5 Rh-123結(jié)合激光共聚焦檢測(cè)線粒體膜電位(ΔΨm) 按照文獻(xiàn)［6]的方法進(jìn)行，收集處理后的各組細(xì)胞用PBS洗滌2次，然后加入羅丹明123(Rh-123)，使其終濃度為 5 mg·L－1，37℃ 閉光孵育20 min，再用PBS洗3遍，激光共聚焦顯微鏡于505 nm激發(fā)光、534 nm發(fā)射光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品中所有受檢測(cè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值的均值，該值即反映相對(duì)ΔΨm的強(qiáng)度。

1．2．6 Western blot檢測(cè) Bcl-2、Cyt C、DR 4 和DR 5

收集處理后的各組細(xì)胞。按常規(guī)方法提取蛋白質(zhì)，恒壓進(jìn)行SDS電泳分離，然后電轉(zhuǎn)到 PVDF膜上，分別與 Bcl-2兔多抗、鼠抗人 DR 4單抗、鼠抗人DR 5單抗、4℃ 孵育過(guò)夜，再加入羊抗兔 IgGHRP室溫孵育1 h，將膜洗滌干凈后，加 TMB顯色液顯色、攝影。一部分細(xì)胞參照文獻(xiàn)分離［8]細(xì)胞質(zhì)蛋白。以 Cyt C鼠單抗為一抗檢測(cè) Cyt C蛋白含量。

1．2．7 統(tǒng)計(jì)與分析 應(yīng)用 SigmaPlot 12．0及 Excel 2003統(tǒng)計(jì)軟件，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次或以上，結(jié)果以x±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩獨(dú)立組間比較采用LSD－t檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2．1 TRAIL對(duì) Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 40μg·L－1TRAIL作用于Hela細(xì)胞12 h后，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用 (P＜ 0．01)。40μg·L－1TRAIL+10 mmol·L－1NAC組雖然也對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用，但與單獨(dú) TRAIL組比較，NAC能明顯減弱 TRAIL對(duì) Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，P=0．000。而單獨(dú)的 NAC對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響(圖1)。

圖1 TRAIL對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用(x ±s，n=4)

2．2 TRAIL引起細(xì)胞GSH、MDA含量的變化

由表1可知，單獨(dú)40μg·L－1TRAIL作用組，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Hela細(xì)胞內(nèi)抗氧化因子 GSH含量與對(duì)照組比較，從2 h開(kāi)始均有顯著降低 (P＜0．01)，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性;氧化應(yīng)激產(chǎn)物 MDA含量在TRAIL作用2 h時(shí)基本不變，只是從4 h開(kāi)始逐漸降低，且呈現(xiàn)時(shí)間依賴性。

40 μg·L－1TRAIL+10 mmol·L－1NAC 組，抗氧化因子 GSH含量從4 h開(kāi)始才略有降低，到8 h GSH 含量仍然有(116．2 ± 4．7)mg·g－1Pro，明顯高于單獨(dú) TRAIL處理8 h GSH含量(57．7±1．2)mg·g－1Pro，與對(duì)照組相比相差不多;而 MDA含量隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)基本維持不變。

表1 TRAIL，NAC+TRAIL作用不同時(shí)間引起GSH、MDA含量變化(x ±s，n=4)

2．3 TRAIL引起細(xì)胞內(nèi) ROS含量變化 由圖2可知，以DCFC-DA轉(zhuǎn)化生成的平均熒光強(qiáng)度代表ROS含量，40μg·L－1TRAIL作用的細(xì)胞從2 h開(kāi)始細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度明顯提高，產(chǎn)生的ROS量隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)不斷升高，到4 h時(shí)ROS的含量已經(jīng)達(dá)到了對(duì)照組的2．33倍。而 NAC能完全抑制TRAIL導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi) ROS的含量升高(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)TRAIL引起細(xì)胞內(nèi)ROS的變化

2．4 TRAIL引起 Hela細(xì)胞 ΔΨm 的變化 如圖3所示，Rh-123熒光強(qiáng)度值反映的是線粒體膜電位(ΔΨm)的大小。TRAIL處理4 h組與對(duì)照組相比ΔΨm變化不大，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，ΔΨm逐漸降低，呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性 (P＜0．01)。而NAC能完全抑制TRAIL引起的ΔΨm下降。

圖3 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞線粒體的Rh-123熒光強(qiáng)度值變化(x ±s，n=4)＊＊

2．5 TRAIL 引起 Hela 細(xì)胞 Bcl-2、Cyt C、DR4、DR5蛋白量的變化 圖4(a)、4(b)顯示，與對(duì)照組相比，40μg·L－1TRAIL作用8 h后能明顯下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，提高死亡受體DR 5的表達(dá)，引起細(xì)胞線粒體內(nèi)Cyt C向細(xì)胞質(zhì)的釋放，但對(duì)死亡受體DR 4的表達(dá)基本沒(méi)有影響。而 NAC能完全抵消TRAIL引起的這些蛋白量的改變。

圖4 TRAIL處理 Hela細(xì)胞中的Bcl－2、Cyt c、DR4、DR5蛋白量的變化

3 討論

近年的研究證實(shí)，氧化應(yīng)激與TRAIL引起的多種細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［2－3]然而 TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的氧化應(yīng)激作用的具體機(jī)制還不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TRAIL對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用(圖1)，我們已經(jīng)證實(shí)這種抑制主要是TRAIL通過(guò)誘導(dǎo) Hela細(xì)胞凋亡進(jìn)行的［4]。抗氧化劑NAC能明顯減弱TRAIL對(duì) Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，與Gatsinzi等報(bào)道的NAC能完全抑制多種藥物聯(lián)合TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用結(jié)果相似［8]。這些表明氧化應(yīng)激在TRAIL引起的Hela細(xì)胞凋亡中起重要作用。

經(jīng)TRAIL處理后，Hela細(xì)胞內(nèi)抗氧化代表物質(zhì)GSH含量從2 h開(kāi)始均有顯著降低(表1)，活性氧ROS的含量也是從2 h開(kāi)始隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)不斷升高。氧化應(yīng)激主要產(chǎn)物 MDA含量在TRAIL作用2 h時(shí)基本不變，只是從4 h開(kāi)始逐漸升高。而抗氧化劑NAC能基本消除TRAIL對(duì)Hela細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激作用 (表1)。GSH、ROS含量變化先于 MDA含量變化。這表明 TRAIL可以使細(xì)胞的氧化應(yīng)激效應(yīng)增強(qiáng)。而這可能是因?yàn)門(mén)RAIL首先抑制了抗氧化物質(zhì) GSH的生成，導(dǎo)致細(xì)胞清除ROS能力降低，使得ROS水平急劇升高，從而引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而導(dǎo)致MDA含量的升高和細(xì)胞增值的抑制，與先前的報(bào)道相一致［7]。

在許多細(xì)胞的凋亡過(guò)程中，ROS的增加與線粒體凋亡途徑關(guān)系密切［7－8]。而 TRAIL誘導(dǎo) Hela細(xì)胞凋亡的可能途徑之一是通過(guò)線粒體進(jìn)行的［6]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了 ROS的增加與線粒體凋亡途徑的關(guān)系。TRAIL處理4 h組與對(duì)照組相比線粒體膜電位 ΔΨm變化不大，到6 h時(shí) ΔΨm明顯降低(圖4)。另外，TRAIL作用8 h后能明顯下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，引起細(xì)胞線粒體內(nèi)Cyt c向細(xì)胞質(zhì)的釋放(圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 ROS的升高 (TRAIL處理2 h時(shí)開(kāi)始不斷升高)是 TRAIL誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的早期事件，要先于 ΔΨm下降 (TRAIL處理 6 h時(shí)開(kāi)始明顯降低)的發(fā)生。而NAC能抑制TRAIL引起的ΔΨm下降，也能完全抵消TRAIL引起的這些蛋白量的改變。提示ROS升高可直接或間接損傷線粒體而引發(fā)線粒體凋亡途徑。其機(jī)制可能是ROS升高引起抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量下降和細(xì)胞線粒體氧化損傷，使線粒體膜電位下降，引起Cyt C等凋亡蛋白的釋放，從而通過(guò)激活Caspases通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

TRAIL作用的主要途徑是與死亡受體DR 4和DR 5結(jié)合，招募FADD(Fas-associated death domain protein)，并進(jìn)一步激活 Caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物，最后將活化信號(hào)傳遞并激活 Caspase-3，從而發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能，這是TRAIL凋亡的非線粒體途徑［9－10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TRAIL處理后能上調(diào)死亡受體 DR 5的表達(dá)，但對(duì)死亡受體DR 4的表達(dá)基本沒(méi)有影響。而 NAC能完全抑制 TRAIL所引起的 DR 5的升高 (圖4)。提示TRAIL誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的可能途徑之一是通過(guò)ROS途徑上調(diào)DR 5表達(dá)而進(jìn)行的，與DR 4無(wú)關(guān)，這與以往的報(bào)道類似［11－12]。

綜上所述，氧化應(yīng)激在 TRAIL引起的 Hela細(xì)胞凋亡中起著重要作用，其機(jī)制可能是TRAIL導(dǎo)致抗氧化物質(zhì) GSH含量降低，清除 ROS能力降低，ROS水平急劇升高。ROS升高一方面導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量下降和細(xì)胞線粒體氧化損傷而激活線粒體凋亡通路。另一方面通過(guò)上調(diào)死亡受體DR 5表達(dá)而執(zhí)行非線粒體凋亡途徑。本實(shí)驗(yàn)為將TRAIL用于臨床腫瘤治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)參考，也為T(mén)RAIL凋亡增敏劑的探索提供了研究基礎(chǔ)。

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