維拉帕米對肉雞肺動脈高壓發(fā)生過程中肺動脈平滑肌細胞c-Fos表達的影響

王建琳，喬 健

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，青島 266109；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

維拉帕米對肉雞肺動脈高壓發(fā)生過程中肺動脈平滑肌細胞c-Fos表達的影響

王建琳1，喬 健2*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，青島 266109；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

研究低溫誘發(fā)肉雞肺動脈高壓過程中肺動脈平滑肌細胞c-Fos的表達情況，及鈣拮抗劑維拉帕米對c-Fos表達和肺動脈壓的影響，從而探討肉雞肺動脈高壓的發(fā)生機制。180只AA肉雞14日齡隨機分為對照組、低溫處理組和維拉帕米組，14～49日齡，每組每周隨機取6只測定肺動脈壓，取肺組織固定做石蠟組織切片進行c-Fos免疫組織化學染色分析。結果顯示，低溫處理1周后肉雞肺動脈壓明顯升高(P<0.05)，20～50 μm肺動脈平滑肌細胞c-Fos表達在處理后1周開始明顯升高，50～100 μm肺動脈c-Fos表達在處理后2周開始明顯升高(P<0.05)，而維拉帕米組肉雞肺動脈壓和c-Fos的表達在相應的時間內(nèi)較低溫組明顯降低(P<0.05)。結果表明肺動脈平滑肌細胞c-Fos在低溫誘發(fā)的肉雞肺動脈壓升高的過程中表達增強，阻斷鈣通道可抑制肉雞肺動脈平滑肌細胞c-Fos的過高表達和肺動脈壓升高。

肉雞；肺動脈壓；平滑肌細胞；c-Fos；維拉帕米

肉雞肺動脈高壓綜合征(pulmonary hypertension syndrome，PHS)是由多種原因引起的，危害快速生長的肉仔雞的一種營養(yǎng)代謝性疾病，以肺動脈壓升高、右心肥大和腹水的形成等為主要臨床特征[1]，肺血管重塑為主要組織學變化特征[2]。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)低溫誘發(fā)肉雞肺動脈平滑肌細胞增殖是肺血管重塑的直接原因[3]，肺動脈平滑肌細胞的增殖是通過細胞周期發(fā)生改變來完成的，而細胞周期的改變與原癌基因的激活和表達增強以及鈣信號的參與密切相關。已研究表明低溫誘發(fā)肉雞肺血管重塑過程中肺動脈平滑肌細胞c-Myc蛋白和c-junmRNA的表達明顯增加[4-5]。利用鈣通道拮抗劑-維拉帕米可明顯抑制低溫誘發(fā)的肉雞肺動脈平滑肌細胞的增殖[6]、肺血管重塑和高壓綜合征的發(fā)生[7]。

研究報道，c-Fos的表達是肺動脈平滑肌細胞增殖的重要因素[8]，且研究發(fā)現(xiàn)間尼索地平能有效抑制肺動脈血管平滑肌細胞增殖和c-fos及c-junmRNA的表達，認為這與鈣離子通道的抑制及抗氧化密切相關[9]。鑒于此，本研究擬對環(huán)境低溫誘發(fā)肉雞肺動脈高壓發(fā)生過程中肺動脈平滑肌細胞c-Fos的表達變化，及應用維拉帕米阻斷鈣通道后c-Fos的表達變化及肺動脈壓的變化進行研究，為肉雞肺動脈高壓的發(fā)生機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物分組

180只1日齡AA商品代肉仔雞(購于北京華都肉雞場)進行常規(guī)的飼養(yǎng)與免疫，14日齡隨機分為3組，每組60只，飼養(yǎng)于空調(diào)動物房內(nèi)。對照組，(21±1)℃環(huán)境飼養(yǎng)；低溫處理組，(10±1)℃環(huán)境飼養(yǎng)；維拉帕米組，(10±1)℃環(huán)境飼養(yǎng)，同時飲用水中添加0.01%維拉帕米。

1.2 肺動脈壓測定

14～49日齡，每組每周隨機取6只肉雞，應用生理多導儀(美國BIO PAC M P150多導生理信號記錄分析系統(tǒng))采用右心導管法直接測定肺動脈舒張壓、肺動脈收縮壓，并計算平均肺動脈壓[10]。

1.3 肺動脈平滑肌細胞c-Fos 表達的研究

肉雞測定肺動脈壓后，翅靜脈注射戊巴比妥鈉處死，取右側(cè)肺葉下1/3 固定、石蠟包埋、組織切片、免疫組織化學染色。采用SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)進行免疫組織化學常規(guī)操作，c-Fos單克隆抗體稀釋度為1∶250，DAB 顯色。顯微鏡下觀察，拍照并結合圖像處理系統(tǒng)進行分析，選擇直徑為20～50 μm和50～100 μm肺動脈計算c-Fos的陽性指數(shù)(PI)，PI(c-Fos)=c-Fos平滑肌細胞陽性數(shù)/平滑肌細胞總數(shù)[5]，其中將c-Fos強染的血管平滑肌細胞(棕色核)作為陽性細胞，相比之下，染色較弱的(淡黃色核)和不著色的(藍色核)作為陰性細胞。

2 結 果

2.1 各組肉雞肺動脈壓變化

肺動脈收縮壓(PASP)在21、42日齡時低溫組顯著高于對照組(P<0.05)，35、49日齡時極顯著高于對照組(P<0.01)；21、49日齡時維拉帕米組顯著低于低溫組(P<0.05)，35日齡時極顯著低于低溫組(P<0.01)。肺動脈舒張壓(PADP)在21、35和42日齡時低溫組顯著高于對照組(P<0.05)；21、28、35、42日齡時維拉帕米組顯著低于低溫組(P<0.05)。平均肺動脈壓(mPAP)在21、35日齡時低溫組極顯著高于對照組(P<0.01)，28、42、49日齡時顯著高于正常組(P<0.05)；21、28、49日齡時維拉帕米組顯著低于低溫組(P<0.05)，35、42日齡時極顯著低于低溫組(P<0.01)(表1)。

2.2 各組肉雞肺小動脈血管平滑肌細胞c-Fos的表達

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，低溫組肉雞肺動脈平滑肌細胞c-Fos陽性細胞較多，而對照組和維拉帕米組較少(圖1～3)。低溫組肉雞20～50μm肺小動脈血管平滑肌細胞PI在 21日齡時顯著高于對照組(P<0.05)，從28日齡開始到49日齡極顯著高于對照組(P<0.01)；維拉帕米組肉雞20～50μm肺小動脈血管平滑肌細胞PI28～49日齡極顯著低于低溫組(P<0.01)，21日齡時顯著低于低溫組(P<0.05)(表2)。低溫組肉雞50～100μm肺小動脈血管平滑肌細胞PI28～49日齡時極顯著高于對照組(P<0.05)；維拉帕米組肉雞50～100μm肺小動脈血管平滑肌細胞PI28～49日齡極顯著低于低溫組(P<0.01)(表3)。

圖1 對照組肉雞肺動脈平滑肌細胞c-Fos陽性細胞較少 (200×) IHCFig.1 Pulmonary artery of broiler in the control group with a little of c-Fos positive cells (200×)

圖2 低溫組肉雞肺動脈平滑肌細胞c-Fos陽性細胞較多(200×) IHC Fig.2 Pulmonary artery of broiler in the low temperature group with lots of c-Fos positive cells (200×)

圖3 維拉帕米組肉雞肺動脈平滑肌細胞c-Fos陽性細胞較少(200×) IHCFig.3 Pulmonary artery of broiler in the verapamil group with a little of c-Fos positive cells (200×)

3 討 論

肉雞PHS的發(fā)生原因較復雜，涉及遺傳、營養(yǎng)、環(huán)境、管理等多方面，其中環(huán)境和營養(yǎng)因素是肉雞PHS的誘發(fā)因素，以環(huán)境低溫誘發(fā)肉雞PHS已成為研究該病發(fā)生機制的主要模型[2-3，11-12]。本研究通過環(huán)境低溫誘發(fā)PHS，用右心導管法直接測定肺動脈壓來評價模型的建立，環(huán)境低溫處理1周后，肺動脈收縮壓和舒張壓都明顯升高，處理3周后再次明顯升高，這可能與低溫誘發(fā)的肺血管重塑促進肺動脈壓升高有關[13]。低溫處理后1周平均肺動脈壓較對照組顯著升高，表明環(huán)境低溫成功誘發(fā)肉雞肺動脈壓升高。

肺血管重塑以肺動脈平滑肌細胞增殖形成的中膜增厚為主要特征，中膜的增厚導致肺動脈管腔縮小，根據(jù)Poiseuille定律，肺血管阻力與動脈管腔半徑的四次方成反比，所以肉雞肺血管重塑可明顯促進肺動脈壓升高[13-14]。根據(jù)以上研究，認為肺動脈平滑肌細胞增殖是肺動脈壓升高的重要因素，而肺動脈平滑肌細胞的增殖受到多種因素調(diào)控，其中原癌基因的表達是重要因素之一。原癌基因c-Fos、c-jun和c-Myc等屬于與生長和分化相關的立即早期基因，對細胞的增殖和分化等具有重要的調(diào)控作用，前期研究表明低溫誘發(fā)的肉雞肺動脈高壓綜合征過程中肺動脈平滑肌細胞c-junmRNA和c-Myc 表達明顯升高[4-5]，表明原癌基因參與肉雞肺動脈高壓形成過程中的肺血管重塑。有研究表明內(nèi)皮素-1誘導的鼠肺動脈平滑肌細胞增殖過程中c-Fos的表達是必不可少的[8]，故本試驗研究環(huán)境低溫誘發(fā)肉雞肺動脈高壓綜合征過程中肺動脈平滑肌細胞c-Fos的表達，結果發(fā)現(xiàn)20～50 μm和50～100 μm肺動脈平滑肌細胞分別從低溫處理后第二周和第三周顯著高于對照組，表明低溫明顯誘發(fā)了肉雞肺動脈平滑肌細胞c-Fos的表達。結合前期對肺動脈平滑肌細胞增殖的研究[3]，20～50 μm肺小動脈平滑肌細胞c-Fos 的表達較對照組顯著增加的時間和細胞顯著增殖的時間相吻合，表明c-Fos的表達與肺動脈平滑肌細胞的增殖密切相關。

當平滑肌細胞在血流剪切力、血管收縮物質(zhì)和缺氧等因素的作用下，細胞外的鈣離子進入細胞或胞內(nèi)鈣離子釋放，提高了細胞質(zhì)中鈣離子的濃度，成為引起細胞反應的信號，這種鈣信號是細胞有絲分裂和增殖所必須的[14]。細胞的胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的升高可導致原癌基因c-Fos的表達，從而促進細胞的增殖[9]。維拉帕米作為一種鈣通道阻滯劑，通過抑制鈣離子內(nèi)流可降低細胞胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的水平，本研究利用其這一作用阻斷鈣信號，研究肺動脈平滑肌細胞c-Fos的表達。研究結果發(fā)現(xiàn)維拉帕米明顯抑制了低溫誘發(fā)的肉雞肺動脈平滑肌細胞c-Fos的表達，此結果與董世山等[15]應用鈣通道拮抗劑對體外培養(yǎng)的肉雞肺動脈血管平滑肌細胞在缺氧刺激后其內(nèi)c-fosmRNA和c-Fos蛋白表達變化的影響相一致。結合前期維拉帕米對肺動脈平滑肌細胞增殖的影響[6]，表明鈣信號參與了低溫誘發(fā)的肉雞肺動脈平滑肌細胞c-Fos的表達，抑制了肺動脈平滑肌細胞的增殖，抑制了肺血管重塑。

鈣信號不僅可以參與肺動脈平滑肌細胞有絲分裂和細胞增殖導致血管重塑，而且可以激發(fā)肺血管收縮，應用鈣離子敏感性受體通道抑制劑阻斷鈣信號后，可明顯抑制肺動脈血管的收縮和重塑，從而抑制肺動脈壓升高[16]。本研究結果發(fā)現(xiàn)維拉帕米明顯抑制低溫誘發(fā)的肉雞肺動脈壓升高，這與其明顯降低低溫誘發(fā)的肉雞肺動脈平滑肌細胞c-Fos的表達、抑制肺動脈平滑肌細胞增殖和肺血管重塑密切相關，也與其抑制肺動脈平滑肌收縮相關。也從反面說明了肺動脈平滑肌細胞c-Fos的表達與肺動脈平滑肌細胞增殖及肺血管重塑密切相關。

4 結 論

維拉帕米明顯抑制低溫誘發(fā)的肉雞肺動脈平滑肌細胞c-Fos的表達和肺動脈高壓，表明鈣信號參與低溫誘發(fā)的肉雞肺動脈平滑肌細胞c-Fos的表達和肺動脈高壓的形成。

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(編輯 白永平)

The Effect of Verapamil on the c-Fos Expression of Pulmonary Artery Smooth Muscular Cells in the Development of Pulmonary Hypertension in Broilers Induced by Low Ambient Temperature

WANG Jian-lin1，QIAO Jian2*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China；2.CollegeofVeterinaryMedicine，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China)

The c-Fos expression of the pulmonary arterial smooth muscle cells in the development of the pulmonary hypertension in broilers induced by low ambient temperature and the effect of verapamil on c-Fos expression were dynamically studied.One hundred and eighty 14-day-old AA broilers were randomised into three groups，control group (21 ℃±1 ℃)，low temperature group (10 ℃±1 ℃) and verapamil group (10 ℃±1 ℃，add 0.01% verapamil in drinking water).Then their pulmonary arterial pressures were measured；and the lungs of broilers were fixed to study the expression of c-Fos.The results showed that the pulmonary arterial pressure in low temperature group significantly higher than those in control group and verapamil group after exposure to low temperature one week (P<0.05)，the expression of c-Fos in 20-50 μm and 50-100 μm pulmonary arteries in low temperature group were significantly higher than those in control group and verapamil group after exposure to low temperature one and two weeks respectively (P<0.05).The results suggested that the expression of c-Fos in pulmonary arteries were significantly increased and verapamil can prevent the high expression of c-Fos and the increase of pulmonary arterial pressure.

broilers；pulmonary arterial pressure；smooth muscle cells；c-Fos；verapamil

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.020

2014-10-30

山東省自然科學基金(ZR2013CL022)；國家自然科學基金(30371063)

王建琳(1976-)，女，山西沁源人，副教授，博士，主要從事禽病發(fā)生機制的研究，E-mail：bjsxxw@126.com

*通信作者：喬 健，教授，博士生導師，E-mail：qiaojian@cau.edu.cn

S852.33

A

0366-6964(2015)08-1432-06