環(huán)丙沙星聯(lián)用磷霉素抗尿路感染耐藥銅綠假單胞菌的協(xié)同作用體外研究

宋 潔，何召云，宮海燕，許思權(quán)，陳先華

（1.中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院預(yù)防保健科，重慶 400038；2.中國(guó)人民解放軍302醫(yī)院肝硬化診療中心，北京 100039）

環(huán)丙沙星聯(lián)用磷霉素抗尿路感染耐藥銅綠假單胞菌的協(xié)同作用體外研究

宋 潔1，何召云2，宮海燕1，許思權(quán)1，陳先華1

（1.中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院預(yù)防保健科，重慶 400038；2.中國(guó)人民解放軍302醫(yī)院肝硬化診療中心，北京 100039）

目的 觀察環(huán)丙沙星和磷霉素聯(lián)合應(yīng)用抗尿路感染耐藥銅綠假單胞菌的體外協(xié)同作用。方法 采用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌分離和菌種鑒定。最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定采用微量肉湯稀釋法，聯(lián)合抑菌濃度指數(shù)（FICI）測(cè)定采用棋盤(pán)法。結(jié)果 82株耐環(huán)丙沙星銅綠假單胞菌中，環(huán)丙沙星和磷霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)22株細(xì)菌有協(xié)同抗菌作用，占26.83%。急性殺菌作用中，選取環(huán)丙沙星和磷霉素聯(lián)合應(yīng)用后協(xié)同抗菌作用和環(huán)丙沙星 MIC降低均最明顯的銅綠假單胞菌P34和P58作為研究對(duì)象，結(jié)果在藥物處理8 h時(shí)，環(huán)丙沙星和磷霉素聯(lián)合處理組的細(xì)菌數(shù)明顯低于兩種藥物單獨(dú)處理組。濁度試驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物處理3 h后，聯(lián)合用藥組與單獨(dú)用藥組細(xì)菌濁度出現(xiàn)明顯差異。結(jié)論 環(huán)丙沙星和磷霉素聯(lián)合應(yīng)用不但具有抗耐環(huán)丙沙星銅綠假單胞菌的協(xié)同作用，且具有較強(qiáng)的殺菌效果和溶菌作用。

尿路感染；環(huán)丙沙星；磷霉素；銅綠假單胞菌；協(xié)同作用

尿路感染約占院內(nèi)感染的40%，由于發(fā)病率高，不但會(huì)增加患者死亡率，還會(huì)增加患者的精神負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已引起臨床高度關(guān)注［1］。大腸埃希菌仍是醫(yī)院或社區(qū)獲得性簡(jiǎn)單尿路感染中最常見(jiàn)的細(xì)菌病原體，然而在復(fù)雜的尿路感染中，僅20%左右的感染由大腸埃希菌引起，銅綠假單胞菌是最重要的病原菌［2］。尤其在長(zhǎng)期留置導(dǎo)尿管的患者中，約35%的導(dǎo)尿管相關(guān)尿路感染由銅綠假單胞菌引起［3］。大多數(shù)銅綠假單胞菌具有較高的耐藥性，且可在抗菌藥物治療過(guò)程中獲得新的耐藥性或形成細(xì)菌生物膜，使得尿路感染反復(fù)發(fā)作、遷延難愈。目前，臨床口服喹諾酮類(lèi)藥物的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致銅綠假單胞菌耐藥性的出現(xiàn)［4－5］。磷霉素是一種天然的抗菌劑，具有廣譜的抗菌活性［6－7］。磷霉素因其良好的穩(wěn)定性、理想的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)、良好的耐受性和臨床療效，已成功地用于治療簡(jiǎn)單的尿路感染［8］。環(huán)丙沙星與磷霉素聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)囊性纖維化患者感染的銅綠假單胞菌有協(xié)同抗菌作用［9］。然而，這兩種抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)尿路感染的銅綠假單胞菌的協(xié)同作用鮮有報(bào)道。為此協(xié)同作用，筆者以耐環(huán)丙沙星的銅綠假單胞菌為研究對(duì)象，檢測(cè)其聯(lián)合抑菌濃度指數(shù)（FICI）和急性殺菌作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源、藥物、試劑與設(shè)備

82株耐環(huán)丙沙星銅綠假單胞菌臨床菌株分離于西南醫(yī)院尿路感染患者的臨床送檢標(biāo)本，剔除同一患者的重復(fù)菌株。根據(jù)《美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS，2010）標(biāo)準(zhǔn)》，環(huán)丙沙星對(duì)銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度（MIC）≥4 μg／mL定義為耐藥。質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌（ATCC27853，中國(guó)藥品生物制品檢定所）。環(huán)丙沙星（CIP，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；磷霉素（FOS，Sigma公司）。營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（重慶龐通醫(yī)藥器材公司）；MH培養(yǎng)基（北京陸橋生物技術(shù)有限公司）；胰蛋白胨、酵母提取物（英國(guó)Oxoid公司）。VITEK－2型全自動(dòng)細(xì)菌分析儀（法國(guó)生物梅里埃公司）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 MIC和FICI檢測(cè)

抗菌藥物對(duì)銅綠假單胞菌的 MIC檢測(cè)采用微量肉湯稀釋法。細(xì)菌劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取菌落于0.9%氯化鈉注射液3～5 mL校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，再用MH肉湯稀釋成1∶100，使含菌量為106cfu／mL?？咕幬镉肕H肉湯2倍稀釋成一系列質(zhì)量濃度（0.5～1 024.0 μg／mL）。然后每孔加100 μL菌液和100 μL系列質(zhì)量濃度的抗菌藥物，使得藥物最終質(zhì)量濃度為0.255～12.0 μg／mL。96孔板置37℃培養(yǎng)箱孵育16～20 h后觀察結(jié)果。

FICI測(cè)定采用棋盤(pán)法。FICI＝環(huán)丙沙星聯(lián)合時(shí)的 MIC／環(huán)丙沙星單用時(shí)的 MIC＋磷霉素聯(lián)合時(shí)的 MIC／磷霉素單用時(shí)的MIC。FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FICI≤4.0為無(wú)關(guān)作用，F(xiàn)ICI＞4.0為拮抗作用。

1.2.2 殺菌作用

選取環(huán)丙沙星和磷霉素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，協(xié)同作用和環(huán)丙沙星MIC降低均最明顯的銅綠假單胞菌P34和P58作為研究對(duì)象。細(xì)菌首先接種于LB平板，37℃培養(yǎng)18 h；分別挑取單菌落于10 mL LB培養(yǎng)基，37℃恒溫震蕩培養(yǎng)18 h；取100 μL過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于10 mL LB培養(yǎng)基，37℃、200 r／min下震蕩培養(yǎng)2 h。每個(gè)菌株均分為空白對(duì)照組、環(huán)丙沙星組、磷霉素組、環(huán)丙沙星＋磷霉素組。空白對(duì)照組不加藥物，其他各組藥物的終濃度均為1／2 MIC。然后分別于0，2，4，6，8，10 h時(shí)取樣100 μL，菌液適當(dāng)稀釋后均勻涂布于LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.3 濁度試驗(yàn)

分別取銅綠假單胞菌P34和P58的上述過(guò)夜培養(yǎng)物100 μL，轉(zhuǎn)接于10 mL LB培養(yǎng)基，在37℃及200 r／min下振蕩培養(yǎng)2 h。試驗(yàn)分為空白對(duì)照組、環(huán)丙沙星組、磷霉素組、環(huán)丙沙星＋磷霉素組。環(huán)丙沙星和磷霉素藥物終濃度均為1／2 MIC。細(xì)菌分組處理后分別于每1 h取樣100 μL，連續(xù)取樣9 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在570 nm波長(zhǎng)處的吸光度值（OD570）。

2 結(jié)果

2.1 兩藥聯(lián)用的FICI測(cè)定結(jié)果

82株耐環(huán)丙沙星銅綠假單胞菌中，F(xiàn)ICI≤0.5者 22株（26.83%），0.5＜FICI≤4.0者60株（73.17%），F(xiàn)ICI＞4.0者0株（0）。環(huán)丙沙星和磷霉素聯(lián)合對(duì)耐環(huán)丙沙星銅綠假單胞菌均無(wú)拮抗作用。

2.2 兩藥聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌的殺菌作用

結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。聯(lián)合用藥后，環(huán)丙沙星對(duì)銅綠假單胞菌P34和P58的 MIC降低至不超過(guò)8 μg／mL，聯(lián)合用藥對(duì)這兩株菌的FICI分別為0.250和0.375，具有較好的協(xié)同作用。菌株P(guān)34在8 h時(shí)，空白對(duì)照組的細(xì)菌數(shù)為lg 9.2 cfu／mL，環(huán)丙沙星和磷霉素單獨(dú)處理組分別為lg 7.2和lg 7.0 cfu／mL，而環(huán)丙沙星和磷霉素聯(lián)合處理組為lg 3.5 cfu／mL。菌株P(guān)58在8 h時(shí)，空白對(duì)照組的細(xì)菌數(shù)為lg 9.6 cfu／mL，環(huán)丙沙星和磷霉素單獨(dú)處理組分別為lg 7.4 cfu／mL和lg 7.8 cfu／mL，而環(huán)丙沙星和磷霉素聯(lián)合處理組為lg 4.7 cfu／mL。

表1 環(huán)丙沙星與磷霉素單用和聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌P34和P58的 MIC和FICI

2.3 兩藥聯(lián)用對(duì)細(xì)菌濁度的影響

聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)菌濁度的影響見(jiàn)圖2。菌株P(guān)34和P58分組培養(yǎng)3 h后，聯(lián)合用藥組的細(xì)菌濁度顯著低于單獨(dú)用藥組。

圖1 環(huán)丙沙星與磷霉素聯(lián)用對(duì)銅綠假單胞菌的殺菌作用

圖2 環(huán)丙沙星與磷霉素聯(lián)用對(duì)細(xì)菌濁度的影響

3 討論

銅綠假單胞菌是院內(nèi)感染的重要條件致病菌，是引起免疫抑制、惡性腫瘤、囊性纖維化、燒傷及尿路感染患者死亡的重要原因［10］。在銅綠假單胞菌引起的尿路感染患者中，敏感菌株引起的死亡率達(dá)23%，而多重耐藥菌株引起的死亡率高達(dá)67%［11］。因此，多重耐藥銅綠假單胞菌的出現(xiàn)為尿路感染患者的治療帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。國(guó)內(nèi)外均有研究［10，12－13］表明，不同種類(lèi)抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用抗銅綠假單胞菌具有協(xié)同作用。本試驗(yàn)中，環(huán)丙沙星和磷霉素聯(lián)合應(yīng)用后，對(duì)22株（26.83%）耐環(huán)丙沙星銅綠假單胞菌表現(xiàn)出協(xié)同作用，無(wú)拮抗作用，與國(guó)外研究［9］報(bào)道基本一致。這表明抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用后，對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用顯著優(yōu)于單一抗菌藥物的使用。銅綠假單胞菌的一個(gè)固有耐藥性是其細(xì)胞壁具有低滲透性，從而能限制抗菌藥物的進(jìn)入。聯(lián)合抗菌藥物對(duì)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)表明，環(huán)丙沙星和磷霉素聯(lián)合應(yīng)用比單獨(dú)使用具有更好的殺菌效果和溶菌作用。這可能是由于環(huán)丙沙星能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁，而磷霉素可增加細(xì)胞壁的滲透作用。Hiromi等［14］和Koichi等［15］報(bào)道，氧氟沙星和磷霉素聯(lián)用抗銅綠假單胞菌具有協(xié)同作用。這充分表明磷霉素能通過(guò)影響細(xì)胞壁合成來(lái)改變銅綠假單胞菌的膜滲透性。近年來(lái)，多重耐藥銅綠假單胞菌引起的尿路感染患者數(shù)量不斷增加，然而臨床幾乎無(wú)有效的抗菌藥物可對(duì)抗這些耐藥菌株。本研究結(jié)果為磷霉素和環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用對(duì)尿路感染耐藥銅綠假單胞菌的協(xié)同抗菌作用研究和開(kāi)發(fā)更為有效的治療方案提供了線索，但仍需進(jìn)一步深入研究。

［1］Mittal R，Aggarwal S，Sharma S，et al.Urinary tract infections caused by Pseudomonas aeruginosa：a minireview［J］.J Infect Public Health，2009，2（3）：101－111.

［2］Moore KN，Day RA，Albers M.Pathogenesis of urinary tract infections：a review［J］.J Clin Nurs，2002，11（5）：568－574.

［3］Ronald A.The etiology of urinary tract infection：traditional and emerging pathogens［J］.Dis Mon，2003，49（2）：71－82.

［4］Coban AY，Ekinci B，Durupinar B.A multidrug efflux pump inhibitor reduces fluoroquinolone resistance in Pseudomonas aeruginosa isolates［J］.Chemotherapy，2004，50（1）：22－26.

［5］Drago G，Vecchi ED，Nicola L，et al.Activity of levofloxacin and ciprofloxacin in combination with cefepime，ceftazidime，imipenem，piperacillin－tazobactam and amikacin against differentPseudomonas aeruginosa phenotypes and Actinetobacter spp［J］.Chemotherapy，2004，50（4）：202－210.

［6］Karageorgopoulos DE，Wang R，Yu XH，et al.Fosfomycin：evaluation of the published evidence on the emergence of antimicrobial resistance in Gram－negative pathogens［J］.J Antimicrob Chemother，2012，67（2）：255－268.

［7］Falagas ME，Maraki S，Karageorgopoulos DE，et al.Antimicrobial susceptibility of Gram－positive non－urinary isolates to fosfomycin［J］.Int J Antimicrob Agents，2010，35（5）：497－499.

［8］Cai Y，F(xiàn)an Y，Wang R，et al.Synergistic effects of aminoglycosides and fosfomycin on Pseudomonas aeruginosa in vitro and biofilm infections in a rat model［J］.J Antimicrob Chemother，2009，64（3）：563－566.

［9］Figueredo VM，Neu HC.Synergy of ciprofloxacin with fosfomycin in vitro against Pseudomonas isolates from patients with cystic fibrosis［J］.J Antimicrob Chemother，1988，22（1）：41－50.

［10］Yasmin F，Akhtar N，Hameed A.In vitro synergistic effect of ciprofloxacin with aminoglycosides against multidrug resistant－Pseudomonas aeruginosa［J］.Pak J Pharm Sci，2013，26（5）：1 041－1 044.

［11］Obritsch MD，F(xiàn)ish DN，MacLaren R，et al.Nosocomial infections due to multidrug－resistant Pseudomonas aeruginosa：epidemiology and treatment options［J］.Pharmacotherapy，2005，25（10）：1 353－1 364.

［12］Walkty A，Karlowsky JA，Adam H，et al.In vitro activity of ceftolozanetazobactam against Pseudomonas aeruginosa isolates obtained from patients in Canadian hospitals in the CANWARD study，2007 to 2012［J］. Antimicrob Agents Chemother，2013，57（11）：5 707－5 709.

［13］盧亞林，萬(wàn) 軍，周麗娜.頭孢曲松和慶大霉素對(duì)銅綠假單胞菌協(xié)同作用的探討［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，2006，13（20）：3 574－3 575.

［14］Kumon H，Ono N，Iida M，et al.Combination effect of fosfomycin and ofloxacin against Pseudomonas aeruginosa growing in a biofilm［J］.Antimicrob.Agents Chemother，1995，39（5）：1 038－1 044.

［15］Monden K，Ando E，Iida M，et al.Role of fosfomycin in a synergistic combination with ofloxacin against Pseudomonas aeruginosa growing in a biofilm［J］.J Infect Chemother，2002，8（3）：218－226.

On the In Vitro Synergistic EffectofCiprofloxacin Combined with Fosfomycin against Drug-Resistant Pseudomonas Aeruginosa Isolates from Urinary Tract Infections

Song Jie1，He Zhaoyun2，Gong Haiyan1，Xu Siquan1，Chen Xianhua1
（1.Department of Prevention and Health Care，Southwest Hospital，Third Military Medical University，Chongqing，China 400038；
2.Liver Cirrhosis Diagnosis and Therapy Center，302 Hospital of PLA，Beijing，China 100039）

ObjectiveTo investigate the in vitro synergistic effect of ciprofloxacin combined with fosfomycin on ciprofloxacin-resistant Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from urinary tract infections.MethodsThe isolation and identification of Pseudomonas aeruginosa were performed by using the traditional procedures.The minimum inhibitory concentration（MIC）testing was determined by using the microdilution broth method.The fractional inhibitory concentration index（FICI）was tested by using the checkerboard method.ResultsAmong the 82 ciprofloxacin-resistantPseudomonas aeruginosa isolates，the synergistic effect of ciprofloxacin combined with fosfomycin was observed in 22 strains（26.83%）.In the acute bactericidal effect experiments，Pseudomonas aeruginosa isolates P34 and P58 as the most obvious synergistic effect and the reduced MIC of ciprofloxacin were selected as the research subjects.The results showed that the viable cell count at 8 h after medication treatment in the ciprofloxacin and fosfomycin combination treatment group was significantly fewer than that of the single drug treatment group.The turbidity test results showed that the significant difference at 3 h after medication treatment was observed between the ciprofloxacin and fosfomycin combination treatment group and the single drug treatment group.ConclusionThe combination of ciprofloxacin and fosfomycin not only induces a synergistic effect on ciprofloxacin-resistant Pseudomonas aeruginosa strains，but also has a strong bactericidal effect and bacteriolytic effect.

urinary tract infections；ciprofloxacin；fosfomycin；Pseudomonas aeruginosa；synergistic effect

R915；R969.3；R978.69

A

1006－4931（2015）02－0036－03

宋潔（1981－），女，主管醫(yī)師，主要從事預(yù)防保健工作，（電子信箱）song＿songjie＠163.com。

2014－07－28）