陽和湯對(duì)裸鼠荷人乳腺癌組織中CD90表達(dá)的影響及其抑瘤作用

竇建衛(wèi) 任翠翠 郝 云 嚴(yán) 然 楊亦奇

(1 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,西安,710061; 2 甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,蘭州,730000; 3 成都中醫(yī)藥大學(xué),成都,610065)

陽和湯對(duì)裸鼠荷人乳腺癌組織中CD90表達(dá)的影響及其抑瘤作用

竇建衛(wèi)1任翠翠1郝 云2嚴(yán) 然3楊亦奇3

(1 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院,西安,710061; 2 甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,蘭州,730000; 3 成都中醫(yī)藥大學(xué),成都,610065)

目的：探討陽和湯對(duì)裸鼠荷人乳腺癌組織中CD90表達(dá)及其抑瘤作用。方法：將人乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)接種于裸鼠第四乳腺脂肪墊，建立裸鼠荷人乳腺癌模型，隨機(jī)將荷瘤裸鼠分為5組：空白對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組、陽和湯低濃度組、陽和湯中濃度組、陽和湯高濃度組，并于接種后14 d給藥2周，給藥結(jié)束后24 h麻醉,拉頸處死裸鼠，剝離腫瘤組織，稱取瘤質(zhì)量并繪制瘤體生長曲線、計(jì)算抑瘤率及采用免疫組化法測(cè)定組織中CD90的表達(dá)。結(jié)果：1)環(huán)磷酰胺組及陽和湯組CD90表達(dá)均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而環(huán)磷酰胺組與陽和湯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，環(huán)磷酰胺組、陽和湯低濃度組、陽和湯中濃度組、陽和湯高濃度組的表達(dá)陽性率均數(shù)分別為0.34%、0.73%、0.52%及0.42%；2)環(huán)磷酰胺組及陽和湯組腫瘤體積及瘤質(zhì)量均小于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而環(huán)磷酰胺組與陽和湯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，環(huán)磷酰胺組、陽和湯低濃度組、陽和湯中濃度組、陽和湯高濃度組的抑瘤率分別為63.64%、37.45%、47.64%及63.27%。結(jié)論：1)陽和湯對(duì)人乳腺癌組織中CD90表達(dá)具有明顯下調(diào)作用，可能是其抑制乳腺癌的作用機(jī)制之一；2)對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的生長具有明顯抑制作用。

乳腺癌；陽和湯；荷瘤裸鼠模型

乳腺癌是女性最常見惡性腫瘤之一，在發(fā)達(dá)國家，乳腺癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤首位。據(jù)估計(jì)，2013年美國女性乳腺癌的新發(fā)病例234 580例，死亡病例40 030例[1]。我國雖屬低發(fā)的國家，但其發(fā)病率也有明顯上升趨勢(shì)，中國腫瘤登記地區(qū)2009年惡性腫瘤相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已位居女性惡性腫瘤的發(fā)病率首位[2]。據(jù)估計(jì)，全國每年乳腺癌的新發(fā)病例19萬，嚴(yán)重威脅著廣大女性的生命和健康。體外實(shí)驗(yàn)研究資料表明，陽和湯可運(yùn)用于乳腺癌治療，能影響細(xì)胞的周期分布，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[3]。CD90已被證實(shí)對(duì)一些腫瘤有抑制作用[4]，其抑制腫瘤的作用很可能是通過上調(diào)血小板反應(yīng)蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(骨粘連蛋白)及纖維連接蛋白實(shí)現(xiàn)[5]。本實(shí)驗(yàn)通過建立裸鼠荷人乳腺癌模型，探討陽和湯對(duì)裸鼠荷人乳腺癌組織中CD90表達(dá)的影響及其抑瘤作用，為進(jìn)一步研究陽和湯治療乳腺癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物 人乳腺癌組織細(xì)胞系我院臨床分離經(jīng)傳代培養(yǎng)后用于實(shí)驗(yàn)；SPF級(jí)nu/nu裸鼠30只，雌性，6～8周齡，體重(18±2)g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，保持恒定濕度和溫度，飼養(yǎng)過程中所喂養(yǎng)的食物、水及飼養(yǎng)籠和墊料均經(jīng)過高壓滅菌消毒，墊料每天更換1次，裸鼠適應(yīng)環(huán)境1周后開始進(jìn)行成瘤實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥品及主要試劑 陽和湯浸膏由西安交通大學(xué)藥學(xué)院提供；環(huán)磷酰胺購自山西普德藥業(yè)股份有限公司；胎牛血清由我院自行制備；Leibovitz’s L-15培養(yǎng)基購自GIBCO公司；胰酶、青霉素-鏈霉素溶液購自碧云天生物技術(shù)有限公司。人抗人CD90單克隆抗體(美國Bioss公司產(chǎn)品)、二步法免疫組化試劑盒(SP-0023)(美國Zymed公司產(chǎn)品均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。DAB顯色試劑盒(AR-0612)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌組織細(xì)胞分離傳代培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的Leibovitz’s L-15培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，倒置顯微鏡下每天觀察培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長情況，1～2 d換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞數(shù)達(dá)90%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 人乳腺癌裸鼠模型的建立 收集對(duì)數(shù)生長期人乳腺癌細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用PBS緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度約2×107個(gè)/mL，于裸鼠第四乳腺脂肪墊接種，每只裸鼠接種0.2 mL，細(xì)胞數(shù)約為4×106個(gè)，建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型，繼續(xù)在SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)，觀察腫瘤生長。7 d左右即可見裸鼠皮下有腫瘤長出，用游標(biāo)卡尺隔日1次測(cè)量腫瘤大小，14 d左右測(cè)量腫瘤體積約為100～200 mm3可用于實(shí)驗(yàn)(V=1/2ab2，a為最長徑，b為最短徑)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 接種后第14天隨機(jī)將30只荷瘤裸鼠分成5組：空白對(duì)照組(0.9%氯化鈉注射液)、環(huán)磷酰胺組(100 mg/kg)、陽和湯低濃度組(2.5 g生藥/kg：相當(dāng)于人用量5倍)、陽和湯中濃度組(5 g生藥/kg：相當(dāng)于人用量10倍)、陽和湯高濃度組(10 g生藥/kg：相當(dāng)于人用量20倍)，每組6只。次日開始給藥，環(huán)磷酰胺組裸鼠腹腔注射給藥1 mL/只，隔日1次，其他組裸鼠灌胃給藥或生理鹽水20 mL/kg，每日1次，連續(xù)2周。

1.2.4 觀察指標(biāo)

1.2.4.1 腫瘤生長情況 觀察實(shí)驗(yàn)期間裸鼠精神狀態(tài)、進(jìn)食、排便及活動(dòng)情況。于給藥后第1天開始每3 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積，取每組平均數(shù)，制作腫瘤生長曲線；計(jì)算抑瘤率：給藥結(jié)束24 h后麻醉拉頸處死裸鼠，剝離腫瘤組織，稱取瘤質(zhì)量，計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=(1-治療組平均瘤質(zhì)量/對(duì)照組平均瘤質(zhì)量)×100%。

1.2.4.2 組織中CD90表達(dá)影響 給藥結(jié)束24 h后麻醉拉頸處死裸鼠，剝離腫瘤組織，采用免疫組化法檢測(cè)不同組裸鼠乳腺組織標(biāo)本中CD90的表達(dá)：腫瘤組織甲醛固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟、水化，水浴法抗原修復(fù)，按試劑盒應(yīng)用說明進(jìn)行操作，樹膠封片后進(jìn)行顯微鏡下觀察切片，采用二維細(xì)胞識(shí)別技術(shù)統(tǒng)計(jì)CD90的陽性率[6]。每張切片拍攝相同位置1×100的視野，取連續(xù)2個(gè)視野中均可見的細(xì)胞核做定位，記為有效細(xì)胞，確定每個(gè)切片1×100顯微鏡視野中有效細(xì)胞的個(gè)數(shù)并標(biāo)記位置，計(jì)數(shù)單個(gè)及組合的陽性細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)陽性率(%)。

2 結(jié)果

2.1 成瘤情況 各組裸鼠接種人乳腺組織細(xì)胞7 d后均可見皮下腫瘤形成，且腫瘤生長迅速，成瘤率高達(dá)100%，各組裸鼠之間移植瘤體積無明顯差異，裸鼠精神狀態(tài)、飲食、排便及活動(dòng)均無異常。

2.2 陽和湯對(duì)裸鼠荷人乳腺癌瘤體生長影響 造模2周左右腫瘤可生長至實(shí)驗(yàn)所需大小，平均體積約為100～200 mm3，隨機(jī)將動(dòng)物分組進(jìn)行干預(yù)，環(huán)磷酰胺組與陽和湯低、中、高濃度組裸鼠移植瘤生長緩慢，空白對(duì)照組裸鼠移植瘤生長仍然很旺盛。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，環(huán)磷酰胺組、陽和湯各組裸鼠移植瘤體積明顯小于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腫瘤生長曲線見圖1。

圖1 不同實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長曲線

2.3 陽和湯對(duì)裸鼠荷人乳腺癌瘤質(zhì)量和抑瘤率比較 環(huán)磷酰胺組、陽和湯組腫瘤質(zhì)量均小于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而環(huán)磷酰胺組與陽和湯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，環(huán)磷酰胺組、陽和湯低濃度組、陽和湯中濃度組、陽和湯高濃度組的抑瘤率分別為63.64%、37.45%、47.64%及63.27%，見表1。

表1 各組裸鼠荷瘤平均質(zhì)量及抑瘤率的比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01;與陽和湯低濃度組比較，△P<0.05。

2.4 陽和湯對(duì)裸鼠荷人乳腺癌組織中CD90表達(dá)的影響 環(huán)磷酰胺組及陽和湯組CD90表達(dá)均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而環(huán)磷酰胺組與陽和湯組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，環(huán)磷酰胺組、陽和湯低濃度組、陽和湯中濃度組、陽和湯高濃度組的表達(dá)陽性率均數(shù)分別為0.34%、0.73%、0.52%及0.42%，見表2。

表2 各組裸鼠荷瘤CD90表達(dá)陽性率的比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

乳腺癌相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)的乳巖。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)因虛致實(shí)、因?qū)嵏?、虛?shí)夾雜的復(fù)雜過程，其實(shí)質(zhì)仍為本虛標(biāo)實(shí)證。古代醫(yī)家對(duì)乳巖已有了較完整的認(rèn)識(shí)，如《外證醫(yī)案匯編》：“正氣虛則為巖?！薄吨T病源候論》曾有“乳石癰”之說，《外科真詮》中有“石榴翻花發(fā)”之記載?！夺t(yī)宗金鑒》對(duì)其描述為“堅(jiān)硬巖形引腋胸”，認(rèn)識(shí)到乳癌晚期可轉(zhuǎn)移至胸壁和腋窩。清·王維德在《外科證治全生集》中所創(chuàng)制之陽和湯具有溫陽散寒通滯、化陰凝而布陽和之效，被廣泛用于治療“氣血寒而毒凝”之陰疽等癥，其后分析乳巖病因?yàn)榘Э迲n愁、患難驚恐之情志所傷，病機(jī)為氣血虧虛、陰損及陽、寒凝痰聚血瘀，病性屬寒，其臨床表現(xiàn)既虛且寒。故采用陽和通腠、溫補(bǔ)氣血之法，將陽和湯用于治療乳巖[7]。

陽和湯由熟地黃，肉桂，麻黃，鹿角膠，白芥子，姜炭，生甘草等組成。方中重用熟地黃溫補(bǔ)營血，且恐草木之品補(bǔ)力不足，依據(jù)“形不足者溫之以氣，精不足者補(bǔ)之以味”之說，選血肉有情之鹿角膠，補(bǔ)髓養(yǎng)血益精、壯筋健骨，二藥配伍，陰中求陽，使陽得陰助，生化無窮，則溫陽之功速達(dá)。腎藏精主骨，肝藏血主筋，精血充足則肝腎旺盛，肝腎旺盛則筋骨強(qiáng)，附著于筋骨之寒邪則可驅(qū)。寒邪附于肌肉、筋骨及血脈之中，炮姜炭、肉桂、麻黃、白芥子等溫?zé)嶂?，共奏?qū)散寒邪之功。其中麻黃、肉桂、炮姜配伍，王洪緒自解：“……治之之法，非麻黃不能開腠理，非肉桂、炮姜不能解其寒凝。此三味雖酷暑不可缺一也。腠理一開，寒凝一解，氣血乃行，毒跡隨之消矣?！倍夤鹋c炮姜炭均入血分，既可溫經(jīng)散寒、通陽散結(jié)解寒凝，又可引熟地黃、鹿角膠直達(dá)病所。麻黃辛溫宣散開腠理，得熟地黃通絡(luò)而不發(fā)表；大量熟地黃得小量麻黃，則補(bǔ)而不膩；白芥子通陽散滯而消痰結(jié)，可祛皮里膜外之痰。本方溫陽散寒之法一者可以直化陰痰，二者使血得陽氣而行，血瘀一解，則痰瘀腫塊更易消散。甘草解毒且調(diào)和諸藥。諸藥共用，針對(duì)血虛陽傷之本，寒凝痰滯之標(biāo)，是溫陽藥和補(bǔ)陰藥合用，滋膩與辛散之品相配，溫而不燥、補(bǔ)而不膩。配伍組方亦照顧全面，表里內(nèi)外均有藥物到達(dá)，使寒邪無稽留之所，則氣滯、血瘀、痰凝、毒聚互結(jié)所生之乳巖自散。

陽和湯的現(xiàn)代研究文獻(xiàn)甚多，高氏等采用荷瘤模型裸鼠進(jìn)行在體抑瘤實(shí)驗(yàn)，對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，觀察陽和湯對(duì)動(dòng)物移植性腫瘤的抑制作用和可能的作用機(jī)理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽和湯可明顯抑制人小細(xì)胞肺癌在裸鼠體內(nèi)的生長[8]。劉氏等將陽和湯用于乳腺癌晚期患者，配合黨參、茯苓、半夏等可有效防治放、化療消化道毒性反應(yīng)，結(jié)果證實(shí)可增強(qiáng)免疫監(jiān)視系統(tǒng)功能，提高機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫，刺激骨髓造血功能，提高癌癥患者體內(nèi)cAMP水平；調(diào)整cAMP和GMP比值，有利于抑制癌細(xì)胞生長，增強(qiáng)化療效果，并能促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)的生物合成，對(duì)化療有一定的增敏增效作用，且能防治其毒性反應(yīng)[9]。

本研究建立裸鼠荷人乳腺癌模型，通過體內(nèi)抑制腫瘤生長實(shí)驗(yàn)，隨著陽和湯濃度增加，瘤體組織中CD90表達(dá)明顯下調(diào)，腫瘤體積與瘤質(zhì)量逐漸減小，抑瘤率逐漸增加，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明陽和湯在裸鼠體內(nèi)可以抑制人乳腺癌細(xì)胞的增殖；實(shí)驗(yàn)研究還表明，陽和湯對(duì)裸鼠荷人乳腺癌組織中CD90表達(dá)具有明顯下調(diào)作用，此可能是其抑制乳腺癌的作用機(jī)制之一，陽和湯下調(diào)組織中CD90表達(dá)、作用于巨噬細(xì)胞通路，抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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(2015-01-08收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Yanghe Decoction's Impact on the expression of CD90 and its antitumor effect in nude mice bearing human breast cancer

Dou Jianwei1，Ren Cuicui1，Hao Yun2，Yan Ran3, Yang Yiqi3

(1SchoolofPharmacy,Xi’anJiaoTongUniversity,Xi’an710061,China; 2Basicmedicalcollege,GansuUniversityofTraditionalChineseMedicine,Lanzhou730000,China; 3ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610065,China)

Objective:To explore the effect of Yanghe Decoction on the expression of CD90 and its antitumor effect in nude mice bearing human breast cancer. Methods:The breast cancer cells were injected into the fourth mammary fat pads of nude mice， establishing the model of nude mice bearing human breast cancer. Then the mice were randomly divided into 5 groups: blank control group, cyclophosphamide group, Yanghe Decoction low dose group, middle dose group and high dose group. After 14 days inoculation, model mice were administered, tumors were collected after 2 weeks. Tumor weight and expression of CD90 were measured. Results: With regards to expression of CD90 and tumor volume and weight, cyclophosphamide group and Yanghe all dose groups were statistically lower than those of the blank control group (P<0.05), but there was no significant differences between the cyclophosphamide group and Yanghe dose groups (P>0.05). The positive expression rate of cyclophosphamide group, low, middle, high dose groups were 0.34%, 0.73%, 0.52% and 0.42%; the tumor inhibition rates were 63.64%, 37.45%, 47.64% and 63.27%. Conclusion: Yanghe Decoction can obviously inhibit the growth of human breast cancer cells and down-regulate CD90 in human breast cancer tissue, which may be one of the mechanisms of breast cancer inhibition.

Breast cancer; Yang He Decoction; Nude mice model

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81473669)；四川省科技廳項(xiàng)目(編號(hào)：2014JY0243)

竇建衛(wèi)(1968—)，男，陜西蒲城人，西安交通大學(xué)副教授，博士，研究方向：主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，E-mail:djw@mail.xjtu.edu.cn

楊亦奇(1990—)，女，山西潞城人，成都中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向：主要從事腫瘤病證治法與方藥研究，E-mail:1192457981@qq.com

R289.9

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.03.023