活血散對(duì)大鼠急性軟組織損傷PGE2及IL-6影響的實(shí)驗(yàn)研究

孫 欣 尹 宏 卞 勇 錢(qián)衛(wèi)慶

(1 南京中醫(yī)藥大學(xué),南京,210023; 2 南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,南京市中醫(yī)院骨科,南京,210001)

活血散對(duì)大鼠急性軟組織損傷PGE2及IL-6影響的實(shí)驗(yàn)研究

孫 欣1尹 宏2卞 勇1錢(qián)衛(wèi)慶2

(1 南京中醫(yī)藥大學(xué),南京,210023; 2 南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,南京市中醫(yī)院骨科,南京,210001)

目的:觀察活血散對(duì)大鼠急性軟組織損傷模型血清PGE2及IL-6影響,初步探討其干預(yù)軟組織損傷模型修復(fù)的可能機(jī)制。方法:造模后,隨機(jī)分組,給予相應(yīng)藥物,動(dòng)態(tài)觀察大鼠損傷癥候指數(shù)評(píng)分、組織形態(tài)學(xué)指標(biāo),并測(cè)量大鼠血清中PGE2、IL-6含量,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:活血散軟膏組在損傷癥候指數(shù)、組織形態(tài)學(xué)方面優(yōu)于模型組?；钛④浉嗫山档痛笫笱逯蠵GE2、IL-6含量。結(jié)論:活血散軟膏具有消腫、止痛、抗炎、促進(jìn)軟組織肌纖維修復(fù)的作用,其作用發(fā)生機(jī)制可能與抑制損傷局部組織中的PGE2、IL-6含量升高有關(guān)。

活血散;軟組織損傷;實(shí)驗(yàn);大鼠;PGE2;IL-6

急性軟組織損傷是骨傷科臨床常見(jiàn)病,臨床主要表現(xiàn)為局部腫脹、疼痛、功能障礙、發(fā)紺瘀斑等?；钛?制劑批準(zhǔn)文號(hào):蘇藥制字Z04000807)是南京市中醫(yī)院骨傷科自制制劑,有活血散瘀、消腫止痛之功效,該院在長(zhǎng)期的臨床工作中將活血散調(diào)制成軟膏,敷于患傷,治療急、慢性軟組織損傷,取得非常好的臨床效果及患者的好評(píng)。通過(guò)臨床研究[1-2]證明活血散對(duì)患者軟組織急性損傷的疼痛、壓痛、腫脹、瘀斑及功能等臨床癥狀、體征有比較顯著的治療效果,但關(guān)于活血散對(duì)疾病療效的治療機(jī)制研究目前還處于缺失狀態(tài),這些嚴(yán)重制約活血散對(duì)急性軟組織損傷的治療效果得到廣泛的認(rèn)可及推廣應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)以大鼠軟組織損傷作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?觀察活血散對(duì)動(dòng)物模型的治療作用,并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 活血散軟膏的主方與制備:1)藥物組方劉寄奴170 g,地膚子170 g,半枝蓮170 g,虎杖170 g,生天南星170 g,土鱉蟲(chóng)75 g,黃柏75 g。全方藥物混勻,60 ℃干燥,粉碎研磨成微細(xì)顆粒。2)活血散凡士林軟膏的制備由南京市中醫(yī)院藥劑科制備提供,其中羊毛脂含量10%,藥物含量20%。3)扶他林乳膏:北京諾華制藥有限公司,批號(hào):X3974。4)白介素-6(IL-6)Elisa試劑盒:上海源葉生物科技有限公司,批號(hào):14112801;5)前列腺素E2(PGE2)Elisa試劑盒:上海源葉生物科技有限公司,批號(hào):14112802。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠,64只,SPF級(jí),北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)條件 給藥前后,SD大鼠分籠飼養(yǎng),每籠5只,喂以全價(jià)顆粒鼠飼料(南京協(xié)同生物工程有限公司),自由飲水飲食,室溫20～25 ℃,人工光照12 h/d,室內(nèi)通風(fēng)良好,實(shí)驗(yàn)室相對(duì)濕度:65%～70%。1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備 根據(jù)中藥藥理實(shí)驗(yàn)學(xué)[3]的實(shí)驗(yàn)方法適當(dāng)調(diào)整造模,造模前1 d,大鼠臀部及大腿后側(cè)剃毛,并在距腘窩1 cm大腿后側(cè)處做好標(biāo)記。先用10%的水合氯醛按體重(0.1 mL/100 g)腹腔注射將大鼠淺麻醉,大鼠反抗能力減弱即為麻醉顯效;將大鼠右下肢平放,固定于軟組織打擊器底座臺(tái)(硬木板)上,將1根內(nèi)直徑為2.5 cm PVC管置于右下肢軟組織標(biāo)記點(diǎn)處,在高10 cm處釋放50 g砝碼(直徑2 cm),撞擊接觸面直徑0.8 cm2,在大鼠大腿中部外側(cè)連續(xù)打擊10次,打擊后肉眼即見(jiàn)打擊部位腫脹、瘀血,但無(wú)明顯皮膚破損及出血,單側(cè)后肢跛行,用手觸摸無(wú)明顯骨折及脫位征,無(wú)其他異常情況發(fā)生者確定造模成功。打擊后皮膚破損和明顯骨折的大鼠予以剔除。

1.2.2 給藥 選取造模成功大鼠分為4組,每組16只。正常對(duì)照組(不造模);模型組(造模后,不處理);扶他林乳膏組(給予扶他林乳膏);活血散軟膏組(給予活血散軟膏外涂)。造模成功后不做任何處理,1 h后于軟組織損傷處給予相應(yīng)的藥物。活血散軟膏組和扶他林乳膏組根據(jù)損傷面積大小給藥,涂布面積以超過(guò)受損區(qū)面積一半以上為度,外用特制膠布及衛(wèi)生膠布固定、包扎,每天換藥1次,連續(xù)給藥7 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.3.1 損傷癥候指數(shù) 自造模后,從皮下瘀血、肌肉腫脹及肌肉顏色3方面每天觀察患肢的癥候表現(xiàn),參照李敏[4]等的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分:1)皮下瘀血:多量塊狀計(jì)2分,少量點(diǎn)狀計(jì)1分,無(wú)瘀血者計(jì)0分;2)肌肉腫脹:明顯腫脹計(jì)2分,稍有腫脹計(jì)1分,無(wú)腫脹者計(jì)0分;3)皮膚顏色:紫暗色深計(jì)2分,暗紅色淺計(jì)1分,色澤正常計(jì)0分。

1.2.3.2 血清中炎性遞質(zhì)的測(cè)定 給藥后第3天,每組取8只大鼠,眼眶取血,分離血清,備用。給藥7 d后剩余大鼠眼眶取血,分離血清,備用。用ELISA法測(cè)定PGE2、IL-6的含量,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明完成。

1.2.3.3 肌肉組織病理學(xué)檢測(cè) 給藥后第3天,取血結(jié)束后采用牽拉使頸椎脫臼的方法快速處死大鼠,然后沿大鼠臀、后側(cè)距腘窩1 cm損傷部位為中心,切除肌肉(剔除干凈皮膚、筋膜及骨組織),10%福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋,切片厚4～5 μm,HE染色。給藥7 d后剩余大鼠同樣方法處死,切除肌肉,10%福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋,切片厚4～5 μm,HE染色。

2 結(jié)果

2.1 活血散軟膏對(duì)損傷癥候指數(shù)的影響 造模后,模型組、扶他林乳膏組、活血散軟膏組大鼠很快出現(xiàn)傷肢皮下瘀血、肌肉腫脹及肌肉顏色加深,且傷勢(shì)呈逐漸加重的趨勢(shì),以傷后24 h最為嚴(yán)重,造模1 d后各組大鼠的損傷癥候指數(shù)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說(shuō)明各組大鼠損傷癥候之間具備可比性。由于正常對(duì)照組大鼠未造模,所以未發(fā)現(xiàn)這組大鼠傷肢腫脹、皮下出血的現(xiàn)象。給藥3 d后,活血散軟膏組、扶他林乳膏組大鼠損傷癥候指數(shù)分值均明顯降低,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,0.01)。給藥7 d后,模型組的損傷情況明顯好轉(zhuǎn),而活血散軟膏組、扶他林乳膏組大鼠傷肢胖脹、皮膚癡斑、皮下出血的癥狀都已基本消失?；钛④浉嘟M、扶他林乳膏組大鼠損傷癥候指數(shù)分值均明顯降低,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 活血散軟膏對(duì)損傷癥候指數(shù)的影響±s)

注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01。

表2 活血散軟膏對(duì)大鼠血清PGE2、IL-6的影響

注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01。

2.2 活血散軟膏對(duì)大鼠血清PGE2、IL-6的影響

給藥3 d、7 d后,模型組大鼠血清中PGE2、IL-6含量明顯升高,與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。扶他林乳膏組、活血散軟膏組大鼠血清中PGE2、IL-6含量低于模型組大鼠,與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 給藥3 d后

圖2 給藥7 d后

2.3 組織形態(tài)學(xué)觀察 動(dòng)物處死后,取其肌肉。10%福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋,切片厚4～5 μm,HE染色,病理專業(yè)人員閱片,根據(jù)病變輕重程度,依次半定量為輕度“+”,中度“++”,重度“+++”,無(wú)病變組織標(biāo)記為“-”。病理組織學(xué)觀察結(jié)果如下(見(jiàn)圖1、圖2)。

給藥3 d后正常組肌肉:本組8例肌肉肌纖維清晰,未見(jiàn)顆粒變性、脂肪變性、嗜堿變性,間質(zhì)血管無(wú)充血,間質(zhì)無(wú)水腫及炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肌肉:本組2例肌肉部分肌纖維輕度變性壞死(+),間質(zhì)輕度充血水腫(+),大量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)(++);余6例肌纖維清晰,間質(zhì)血管輕度充血(+),少量出血。扶他林軟膏組肌肉:本組6例肌纖維清晰,間質(zhì)血管輕度充血(+),少量出血。余2例未見(jiàn)明顯異常?；钛④浉嘟M肌肉:本組4例肌纖維清晰,間質(zhì)血管輕度充血(+),少量出血。余4例未見(jiàn)明顯異常。

給藥7 d后正常組肌肉:本組8例肌肉肌纖維清晰,未見(jiàn)顆粒變性、脂肪變性、嗜堿變性,間質(zhì)血管無(wú)充血,間質(zhì)無(wú)水腫及炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肌肉:本組2例肌肉部分肌纖維輕度變性壞死(+),間質(zhì)輕度充血水腫(+),大量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn)(++);2例肌纖維清晰,間質(zhì)血管輕度充血(+),少量出血。余4例未見(jiàn)明顯異常。扶他林軟膏組肌肉:本組6例肌纖維清晰,間質(zhì)血管輕度充血(+),少量出血。余2例未見(jiàn)明顯異常?；钛④浉嘟M肌肉:本組3例肌纖維清晰,間質(zhì)血管輕度充血(+),少量出血。余5例未見(jiàn)明顯異常。

3 討論

急性軟組織損傷是臨床骨科經(jīng)常碰到的疾病之一,類似傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的“傷筋病”,在治療上除了采取一些中藥口服外,中藥外治法也經(jīng)常被廣泛應(yīng)用于一線臨床,目前已經(jīng)開(kāi)展的大量的臨床還有實(shí)驗(yàn)都報(bào)道證明它的療效確切。本病病機(jī)為:氣滯血瘀,絡(luò)脈不和,治療當(dāng)消腫止痛、散瘀通絡(luò)。

活血散方中用劉寄奴、土鱉蟲(chóng)活血化瘀;半枝蓮、虎杖、黃柏、地膚子清熱化瘀;生南星通絡(luò)止痛。諸藥合用,共奏活血去瘀、消腫止痛之功效?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)處方中劉寄奴有顯著抑制血小板聚集反應(yīng)的作用,還有顯著的血栓抑制作用[5];土鱉蟲(chóng)可降低紅細(xì)胞壓積,降低全血高切黏度,全血低切黏度[6-7],具有抗凝和抗血栓形成作用;半枝蓮有解熱、利尿消腫以及一定程度的抗菌作用[8-9],虎杖現(xiàn)代藥理研究證明有抗血小板聚集及降低全血黏度及紅細(xì)胞聚集作用[10],地膚子抗炎抗菌利尿消腫[10],生南星鎮(zhèn)痛明顯[11],黃柏解熱抗炎[11],諸藥合用抑制血小板聚集、抗凝血、抗血栓、解熱鎮(zhèn)痛,利尿消腫抗炎,從而促進(jìn)了局部微循環(huán),對(duì)瘀血吸收產(chǎn)生促進(jìn)作用,從而對(duì)機(jī)體炎性反應(yīng)產(chǎn)生壓制,利于機(jī)體軟組織的自我修復(fù)。這些研究結(jié)果與中醫(yī)學(xué)對(duì)軟組織損傷(損傷)的辨證和治療機(jī)理的認(rèn)識(shí)是一致的。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為創(chuàng)傷導(dǎo)致毛細(xì)血管破裂、出血和血管通透性增加,血管內(nèi)液漏到組織間隙產(chǎn)生炎性反應(yīng)[12],基礎(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn),炎性遞質(zhì)和細(xì)胞因子參與了許多軟組織損傷修復(fù)過(guò)程中,起著對(duì)局部炎性反應(yīng)和組織損傷修復(fù)的重要作用。實(shí)驗(yàn)中大多急性軟組織損傷模型均由機(jī)械物理打擊所得,主要表現(xiàn)為局部組織炎性反應(yīng)(變性、滲出及增生),在這個(gè)過(guò)程中有大量的活性物質(zhì)參加,通過(guò)作用H1受體,使細(xì)動(dòng)、靜脈擴(kuò)張,從而加快了炎性反應(yīng)[13]。IL-6由淋巴、非淋巴細(xì)胞產(chǎn)生,是一種多功能的細(xì)胞因子[14],在免疫反應(yīng)尤其是急性期反應(yīng)中起著重要的作用。PGE2同樣是重要的炎性遞質(zhì),能夠降低疼痛閾值,激活痛覺(jué)外周感受器,在創(chuàng)傷中起著重要作用。

在本次實(shí)驗(yàn)中,活血散軟膏組在損傷癥候指數(shù)、組織形態(tài)學(xué)方面優(yōu)于模型組。在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)上活血散軟膏均降低了血清中PGE2、IL-6的含量,得出結(jié)論:活血散軟膏具有消腫、止痛、抗炎、促進(jìn)軟組織肌纖維修復(fù)的作用,其作用發(fā)生機(jī)制之一就是抑制了血清中PGE2、IL-6的表達(dá)來(lái)發(fā)揮其抗炎作用。本次試驗(yàn)為臨床使用活血散治療急性軟組織損傷提供了藥理學(xué)依據(jù)。

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(2015-04-30收稿 責(zé)任編輯：王明)

Effect of Huoxuesan on PGE2and IL-6 in the Treatment of Rat Acute Soft Tissue Injury

Sun Xin1, Yin Hong2, Bian Yong1, Qian Weiqing2

(1NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China; 2NanjingThirdAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicineHospitalofOrthopaedics,Nanjing210001,China)

Objective: To observe the effect of Huoxuesan on PGE2and IL-6 level in rats with acute soft tissue injury so as to explore the possible mechanism of Huoxuesan in restoring soft tissue damage. Methods: After modeling, rats were randomized into two groups and given different drugs. Dynamic observation was conducted on the aspects of injury symptom index, histomorphology index, and serum level of PGE and IL-6 respectively, followed by statistical analysis. Results: The group used Huoxuesan performs better in injury symptom score and histomorphology score. Huoxuesan can also lower the levels of PGE2and IL-6 in rats' serum. Conclusion: Huoxuesan can diminish inflammation and swelling and relieve pain. It can also contribute to the restore of soft issue. This may due to its determent on the levels of PGE2and IL-6.

Huoxuesan; Soft tissue injuries; Experiment; Rats;PGE2; IL-6

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào):31360629)

孫欣(1979—),男,漢族,南京,南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院2012級(jí)中西醫(yī)結(jié)合外科學(xué)(骨科方向)碩士研究生,南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨傷科主治中醫(yī)師,主要從事中西醫(yī)結(jié)合骨傷病的臨床及研究工作

尹宏(1960—),男,漢族,南京,碩士生導(dǎo)師,南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨傷科主任醫(yī)師,研究方向:關(guān)節(jié)及創(chuàng)傷骨科,Tel:(025)52276204,E-mail:hongy6011@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2015.06.025