高脂微藻的選育研究進展

摘 要:生物柴油具備與石油柴油相近的性能,最近作為一種可再生的替代能源受到人們的普遍關(guān)注。用藻類生產(chǎn)生物燃料可以保持碳平衡,而且進行生產(chǎn)時可利用相對小而貧瘠的荒地,不與農(nóng)爭地。因此,藻類是用來生產(chǎn)生物柴油的最佳原料。本文從野外采集分離篩選、優(yōu)化培養(yǎng)、基因工程構(gòu)建高脂微藻三個方面對高脂微藻的選育的國內(nèi)外進展進行了介紹,并對構(gòu)建工程微藻過程中面臨的問題和應(yīng)采取的對策進行了綜述和展望。

文獻標識碼: A

文章編號:1005-2992(2015)04-0047-05

生物柴油是一種清潔的可再生能源,它是以大豆和油菜籽等油料作物、油棕和黃連木等油料林木果實、工程微藻等油料水生植物以及動物油脂、廢餐飲油等為原料制成的液體燃料,是優(yōu)質(zhì)的石油柴油代用品。目前通過植物作物和動物油脂生產(chǎn)的生物柴油總計只能滿足運輸用油的0. 3%。Chisti通過建立數(shù)學(xué)模型和工程計算得出目前來自于作物生產(chǎn)生物柴油取代石化油是不可能的,他指出,唯一可能取代石化油的生物柴油只能是來自于微藻的生物柴油。

微藻生物柴油成套技術(shù)涵蓋多個技術(shù)環(huán)節(jié),是一個復(fù)雜的系統(tǒng)工程,包括通過對微藻的篩選和培育以獲得性狀優(yōu)良的高含油量藻種,而后在光生物反應(yīng)器中吸收陽光、CO 2等以生成微藻生物質(zhì),最后經(jīng)過采收、加工,轉(zhuǎn)化為微藻生物柴油。優(yōu)良富油藻種的選育是微藻生產(chǎn)生物柴油效率提高與成本降低的關(guān)鍵,涉及微藻含油量、光合效率、生長速率等的研究,其影響因素包括微藻種類、溫度、pH值、鹽堿度、光照等環(huán)境因子,N、Si、P、S和微量元素等營養(yǎng)因子,以及基因工程改造等。選育時需要滿足油脂含量高、生長速度快、油脂組成品質(zhì)好的要求。其次要易于培養(yǎng)、抗污染能力強、營養(yǎng)要求低、易于采集加工等條件。篩選高脂微藻通常有野外采集分離篩選、優(yōu)化培養(yǎng)、應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建高油脂工程微藻幾種途徑,以下一一詳述。

1　野外采集分離篩選

野外采集分離篩選是指從野外采集分離,進而篩選出有產(chǎn)油潛力的株系的一種方法。美國能源部自1978年開始立項利用藻類制備生物柴油的研發(fā)工作,從海洋和湖泊中分離了3 000多種藻類,從中篩選出300多種生長快、含油高的硅藻、綠藻和藍藻等藻種。綠藻屬含油脂量可達22. 5%,硅藻屬含油脂量可達22. 7%,藍藻屬含油脂量可達9. 8%。在脅迫條件下(光脅迫、營養(yǎng)脅迫),綠藻屬含油脂量可達45. 7%,硅藻屬含油脂量可達44. 6%,藍藻屬含油脂量可達44. 6%。而鮮見關(guān)于高油脂藍藻(原核微藻)的報道。這可能是因為藍藻大多不以油脂方式儲存能量,很難在生物柴油合成領(lǐng)域被利用。而硅藻和綠藻中碳則多以油脂的形式儲存,經(jīng)過比較簡單的酯交換反應(yīng)就能轉(zhuǎn)化為生物柴油 [1]。

收稿日期:2015-05-26

作者簡介:趙晴瀟(1980-),女,吉林省吉林市人.東北電力大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院高級實驗師,主要研究方向:破骨細胞分化發(fā)育.

近年來,中國海洋大學(xué)構(gòu)建的海洋藻類種質(zhì)資源庫,已收集了600余株海洋藻類種質(zhì)資源,目前保存有油脂含量接近70%的微藻品種。以中國科學(xué)院各研究所為代表的相關(guān)研究機構(gòu)在藻種的篩選領(lǐng)域已開展了大量的工作,目前篩選出富油富烴微藻66株。從篩選結(jié)果來看,盡管野生型藻株性狀穩(wěn)定,但在光合效率、生長速度以及抗逆性和能量產(chǎn)出等方面仍無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要,相關(guān)性狀有待進一步提高。

2　優(yōu)化培養(yǎng)

優(yōu)化培養(yǎng)是指以現(xiàn)有的代謝體系為基礎(chǔ),通過創(chuàng)造一種生理壓力來調(diào)整代謝流適當(dāng)向油脂合成方向轉(zhuǎn)換,是從生理生化水平對微藻進行代謝調(diào)控來增加油脂總產(chǎn)量的方法。通過對碳源、氮源、磷源、鐵離子、硅等的種類或供應(yīng)量的優(yōu)化,摸索出有利于微藻產(chǎn)油的營養(yǎng)條件。

2.1 碳源對油脂含量的影響

Chiu等研究了CO 2濃度對微綠球藻的生長和脂質(zhì)積累的影響,發(fā)現(xiàn)通入2%CO 2與通入空氣相比,通入2%CO 2可以提高微綠球藻的生長速率和生物量,而更高濃度的CO 2則會抑制微綠球藻的生長。他們對指數(shù)期、穩(wěn)定期早期和穩(wěn)定期的微藻細胞進行脂質(zhì)含量的測定時發(fā)現(xiàn),脂質(zhì)含量分別占干重的30. 8%,39. 7%和50. 4% [2]。

2.2 氮源對油脂含量的影響

許多實驗己經(jīng)證明氮缺乏最容易刺激微藻油脂尤其是三酸甘油的積累。Yanna Liang等通過對Chlorella vulgaris抑氮培養(yǎng),藻細胞脂質(zhì)含量由33%增加到38%。黃建忠等 [3]發(fā)現(xiàn)NH 4NO 3、尿素等適合細胞生長但不適合油脂合成;蛋白胨、牛肉膏不適合細胞生長但利于油脂合成;酵母膏不僅適宜細胞生長,也是油脂合成的最佳氮源。Li等 [4]研究了氮源種類和濃度對Neochloris oleoabundans細胞生長和脂積累的影響,硝酸鹽、氨、尿素是最普遍的氮源形式,其中NaNO 3是該藻生長和脂積累的最適氮源。

2.3 磷源對油脂含量的影響

磷對細胞能量的生物轉(zhuǎn)化相關(guān)過程(如光合磷酸化)非常重要,光合作用需大量蛋白,蛋白合成需要富含磷的核糖體,磷脅迫使光合作用受限,細胞代謝將傾向于脂合成轉(zhuǎn)化,油脂積累。

2.4 其他條件對油脂含量的影響

鐵離子對微藻的生長和脂質(zhì)的積累存在影響,如Liu等發(fā)現(xiàn)當(dāng)小球藻生長達到對數(shù)生長末期時加入鐵離子可以延長對數(shù)生長期,進而增大生物量。將培養(yǎng)到對數(shù)末期的小球藻收集后接種到含有不同濃度鐵離子濃度的新鮮培養(yǎng)基中后,細胞中脂質(zhì)含量有了不同程度的升高,當(dāng)鐵離子濃度達到1. 2×10 25mol / L時脂質(zhì)的含量達到了干重的56. 6%是其他含有低鐵離子濃度培養(yǎng)基的3 -7倍 [5]。Rao等對產(chǎn)烴葡萄藻的研究發(fā)現(xiàn)不同的鹽度對微藻的總脂含量產(chǎn)生不同程度的影響 [6]。Takagi等在高鹽條件下培養(yǎng)Dunaliella,當(dāng)初始鹽濃度從0. 5 M增至1M時,含油量由60%增至67% ;當(dāng)初始鹽濃度為1M,并在對數(shù)期中期或末期加入0. 5 M或1 M鹽時,含油量可增至70% [7]。

從上文中可以看出,在脅迫條件下脂質(zhì)含量會相對增加。但是也有人指出,在缺乏氮源、硅源等必要營養(yǎng)元素的條件下,雖然脂質(zhì)含量相對增加,但是在這種培養(yǎng)條件下微藻的生物量會大大減小,并不能達到增產(chǎn)的目的。大部分微藻細胞大量積累油脂發(fā)生在細胞分裂受阻或抑制,而碳繼續(xù)被細胞固定同化的情況下(如氮短缺等逆境條件),此時細胞含油率迅速增長但細胞數(shù)目增長緩慢(如處于穩(wěn)定期的微藻),這致使總生物量增長減緩進而制約了總油脂生產(chǎn)量的提高。微藻產(chǎn)油脂可分為兩個階段,即藻體增殖期和油脂積累期,這兩個階段對營養(yǎng)鹽要求不同。細胞增殖期是微藻消耗培養(yǎng)基中的氮源,吸收利用蛋白質(zhì),以保證藻體代謝旺盛;當(dāng)藻體細胞增殖率劇增,以消耗碳、氮源為主,并合成積累大量油脂。因此,培養(yǎng)前期宜采用完全培養(yǎng)使細胞快速生長獲取大量藻體,產(chǎn)油階段宜采用營養(yǎng)鹽限制以積累更多脂肪。

在我國最早從事微藻生物柴油研究工作的是清華大學(xué)吳慶余課題組。他們通過調(diào)整碳、氮源的供給,獲得異養(yǎng)小球藻細胞,該細胞不含葉綠素,蛋白質(zhì)含量非常低,而粗脂肪含量卻比自養(yǎng)藻提高了3. 4倍。研究結(jié)果表明,異養(yǎng)藻細胞熱解飽和烴氣的產(chǎn)率是自養(yǎng)藻細胞的32倍。他們利用高脂肪含量的異養(yǎng)藻快速熱解獲得57. 2%的產(chǎn)油率,比自養(yǎng)藻產(chǎn)油率提高了2. 4倍。獲得了與化石燃油相當(dāng)?shù)膬?yōu)質(zhì)生物質(zhì)燃油,熱值分別是木材熱解油和自養(yǎng)藻熱解油的2和1. 4倍,這種熱解油具有化石燃油的相關(guān)特征(密度0. 864 kg·L -1,粘度5. 2×10 -4(40℃),熱值41 MJ·kg -1)。藻類的異養(yǎng)生長,不僅可提高細胞內(nèi)脂類的含量,而且也是提高其生物量的有效途徑。這種培養(yǎng)方式避免了光自養(yǎng)培養(yǎng)過程中光抑制或光限制等問題,降低了能耗,節(jié)約了成本,為工業(yè)化大規(guī)模高密度培養(yǎng)微藻奠定了基礎(chǔ)。目前,異養(yǎng)培養(yǎng)微藻生產(chǎn)生物柴油存在兩個主要問題:一是失去了光自養(yǎng)培養(yǎng)微藻生產(chǎn)生物柴油的五大優(yōu)點(如不僅不能固定CO 2反而會排放出CO 2等);二是成本高(以葡萄糖為碳源,每生長1噸小球藻所需的碳源成本約9 000元)且難以和產(chǎn)油微生物競爭。

3　應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建高油脂工程微藻

基因工程法增油脂是指通過對微藻油脂合成相關(guān)途徑關(guān)鍵基因的操作,從分子水平化解高生長率和高含油率之間的矛盾,以構(gòu)建出能夠快速積累油脂的工程微藻藻株。為提高微藻產(chǎn)油能力,對微藻的改造至少可從以下三方面進行:一是加快微藻的生長速度;二是提高微藻的光合效率;三是增加微藻含油量。目前,研究者主要通過兩個方面的基因操作來提升油脂合成能力:(1)超表達與油脂合成直接或間接相關(guān)的關(guān)鍵酶;(2)阻斷與油脂合成途徑競爭中間代謝物的其他途徑的關(guān)鍵酶。

3.1 超表達與油脂合成直接或間接相關(guān)的關(guān)鍵酶

3. 1. 1 乙酰輔酶A羧化酶研究

脂肪酸的生物合成是以乙酰輔酶A為底物,經(jīng)乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase, ACCase)的催化,開始脂肪酸的合成。ACCase是脂肪酸生物合成途徑的關(guān)鍵限速酶。高等植物有關(guān)ACCase調(diào)控脂類合成的研究表明,高等植物中ACCase的活性高低直接影響脂肪酸的生物合成。美國再生能源國家實驗室(NationalRenewable Energy Laboratory,NREL)于1991年開展了有關(guān)基因工程構(gòu)建高油微藻的工作。并于1995年將ACCase基因轉(zhuǎn)化小環(huán)藻成功 [9,10]。在實驗室條件下可使“工程微藻”中油脂含量增加到60%以上,戶外生產(chǎn)也可增加到40%以上,而一般自然狀態(tài)下微藻的脂質(zhì)含量為5% -20%。預(yù)計每平方米“工程微藻”每年可生產(chǎn)約116 L柴油。目前,他們正在研究選擇合適的分子載體,使ACC基因在細菌、酵母和植物中充分表達,進一步將修飾的ACC基因引入微藻中以獲得更高效表達。天津科技大學(xué)正在開展ACCase調(diào)控微藻脂肪酸合成能力的研究,目前正在篩選轉(zhuǎn)化ACC基因的絲狀體微藻 [11]。

3. 1. 2 蘋果酸酶研究

蘋果酸酶催化蘋果酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸并同時將NADP +還原為NADPH,研究發(fā)現(xiàn)超表達蘋果酸酶而增多的NADPH供應(yīng)會被甘油三酯合成途徑有效利用并導(dǎo)致油脂產(chǎn)量的上升 [12]。Zhang等以卷枝毛霉(Mucor circinelloides)為模型,利用基因工程方法成功實現(xiàn)對蘋果酸酶的過量表達,使其脂肪的合成提高了2. 5倍 [13]。

3. 1. 3 3-磷酸甘油脫氫酶研究

甘油三酯合成的另外一個前體物質(zhì)為甘油-3-磷酸。磷酸二羥丙酮在3-磷酸甘油脫氫酶的催化下可以生成甘油-3磷酸,所以3-磷酸甘油脫氫酶被認為是調(diào)控甘油三酯積累的關(guān)鍵酶之一。在甘藍型油菜中過表達3-磷酸甘油脫氫酶,種子的甘油-3磷酸含量提高了3 -4倍,油脂含量提高了40%。

3. 1. 4 二酯酰甘油?；D(zhuǎn)移酶研究

二酯酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)催化甘油三酯合成的最后一步反應(yīng)。DGAT的底物二酯酰甘油既可以分配到磷脂合成途徑,亦可以分配到TAG合成途徑,超表達DGAT可以使更多的二酯酰甘油分配到TAG合成途徑中而不是形成磷脂 [14]。高等植物DGAT高效表達除了可增加脂生物合成速率,也可促進脂肪酸形成。擬南芥、酵母及煙草中超表達DGAT皆使TAG含量大幅提升,但該酶在微藻中高效表達的研究尚未見報道。

3.2 阻斷油脂合成的競爭途徑

3. 2. 1 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶研究

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)存在于所有光合生物中,是光合作用過程中的關(guān)鍵酶,同時還參與了氨基酸代謝途徑中碳骨架的回補作用等。對脂類代謝而言, ACCase和PEPC共同調(diào)控脂類代謝途徑的方向。當(dāng)丙酮酸合成后,ACCase催化底物乙酸輔酶A進入脂肪酸合成途徑;乙酸輔酶A的濃度累積激活PEPC,催化丙酮酸合成草酸乙酸進入氨基酸生物合成途徑。因此,抑制PEPC的活性有助于促進ACCase催化底物合成脂肪酸。侯李君等通過將藍藻正反義pepcA基因?qū)雽Υ竽c桿菌中脂類合成的調(diào)控的研究發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)反義pepcA片段E. coli中PEPC酶活性降低到野生菌的0. 2%,蛋白質(zhì)合成減少23. 6%,脂類合成增加了46. 9%;而轉(zhuǎn)正義pepcA片段E. coli PEPC酶活性是野生菌的2. 38倍,蛋白質(zhì)合成增加了14. 5%,脂類合成減少了49. 6% ;轉(zhuǎn)基因菌中十八碳酸的含量明顯增加 [15]。目前天津科技大學(xué)正在正在開展反義技術(shù)調(diào)控微藻PEPC代謝途徑的工作,其初步結(jié)果已表明,反義抑制PEPC酶活性可顯著提高藻細胞脂類含量。2005年,趙桂蘭等用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將反義PEPC基因?qū)氪蠖沟幕蚪M,獲得了穩(wěn)定的超高油轉(zhuǎn)基因大豆品系。

3. 2. 2 B2氧化途徑

B2氧化是真核細胞中脂肪酸降解的主要代謝途徑,它會消耗細胞內(nèi)的脂肪酸,而脂肪酸是甘油三酯合成的前體,因此,通過阻斷這條途徑有可能提高甘油三酯的產(chǎn)量。Cao等研究表明部分阻斷B2氧化能促進假絲酵母的二羧酸(一種短鏈脂肪酸)生產(chǎn),然而完全阻斷轉(zhuǎn)運系統(tǒng)則會對細胞的能量供應(yīng)有害 [16];Picataggio等的實驗結(jié)果與之相符 [17]。

3. 2. 3 淀粉合成途徑

此外,在真核藻類細胞中,淀粉也是一類主要的能量儲存物質(zhì),有些研究通過阻斷淀粉的積累來打破細胞內(nèi)能量分配,促進脂肪的積累。衣藻的兩個淀粉合成受阻突變株sta6和sta7,在限氮培養(yǎng)條件下,甘油三酯的積累都提高。小球藻的無淀粉型突變株中多不飽和脂肪酸的含量也提高了4倍 [18]。

國內(nèi)關(guān)于微藻基因工程的研究在最近十年中發(fā)展較快。我國從1998年國家啟動海洋“863”計劃后,參與的人員和獲得的成果增長速度明顯超過國外,成為國際上在藻類基因中表達外源基因最多的國家。采用基因工程手段,培育出遺傳穩(wěn)定、生長迅速的微藻產(chǎn)油株系,以此為基礎(chǔ)構(gòu)建起較為簡單的培養(yǎng)流程并因而降低生產(chǎn)成本,這是促使微藻生物柴油迅速工業(yè)化生產(chǎn)的最關(guān)鍵問題。雖然通過基因工程法促使微藻大量生產(chǎn)油脂尚未成功,但是油料作物如大豆、油菜中的成功案例使我們看到了希望。

4　展 望

目前微藻基因工程在技術(shù)水平上至少有三個問題需要解決:一是發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因;二是尋找合適的載體;三是提高外源基因在藻類中的表達效率。另一方面,快速的生長條件也是降低微藻生物柴油開發(fā)成本的必然要求,即選育和基因工程改造后要符合耐高濃度的CO 2、高溫以及高強度光照的條件。由于空氣中的CO 2只有0. 03% -0. 06%,而環(huán)境中一定濃度的CO 2含量又是微藻快速生長的基本條件,因此工業(yè)廢氣等非自然條件下的環(huán)境就成為了常見的選擇。目前,已有較多的研究者對微藻生長條件進行了研究,部分微藻分別在耐受的CO 2濃度、耐受溫度以及產(chǎn)率等方面表現(xiàn)出較好的特性。

采用基因工程控制關(guān)鍵酶表達來調(diào)控油脂的方法,經(jīng)常會遇到一個問題:即使關(guān)鍵酶在受體細胞中高效表達,但油脂含量并沒有增加,這說明在油脂合成路徑中可能存在多個限制點,而基因工程只提高了其中一個。針對這一問題,有學(xué)者提出同時高效表達多個關(guān)鍵酶基因的想法,但由于多基因操作難度很大,這方面的報道也很少見。最近,又有學(xué)者認為調(diào)控代謝應(yīng)基于整個細胞水平,而非單一路徑水平,提出了轉(zhuǎn)錄因子工程方法(transcription factor engneering approaches,TFE)這一新概念。轉(zhuǎn)錄因子是指通過被特定DNA序列識別并建立蛋白-DNA、蛋白-蛋白相互作用來調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄的蛋白?；蚬こ逃绊懸粋€基因,而轉(zhuǎn)錄因子影響多個代謝路徑的大量基因,進而使多個代謝路徑同時作用來綜合調(diào)控目的產(chǎn)物的生物合成,因此TFE被認為是一種很有潛力的新興技術(shù)。目前該方法在動物、植物、微生物中已有初步研究。在微藻產(chǎn)油方面則剛剛開始,首先需要深入了解微藻轉(zhuǎn)錄因子的生理功能以及確定不同微藻中調(diào)節(jié)油脂合成路徑的轉(zhuǎn)錄因子 [19-20]。

參 考 文 獻

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Recent Advancesin Screening High Lipid Productivity Microalgae

ZHAO Qing-xiao 1,CHEN Xue-mei 1,MA Lin 2

(1. School of Chemical Engineering Northeast Dianli University,Jilin Jilin 132012;2. China Petroleum Jilin Petrochemical Chemical Power Plant,Jilin Jilin 132022)

Abstract: Recently, biodiesel receive extensive attention as a renewable and environmentally friendly alternative energy source due to the similar performance with fossil fuel and conventional fossil fuels shortage. When algae are utilized for biofuel production,the carbon balance is keeped and the agriculture land is saved. Therefore,algae are the best material for biodiesel production. In this paper,we try to introduce the domestic and international progress of high-lipid microalgal screening from three aspects:isolation and screening algae from the nature,optimization of culture and genetic engineering in regulation of lipid metabolism. The problems in the construct of genetic microalgae strains are also discussed in this review.

Key words: Biodiesel;Algae;Genetic engineering