骨髓間充質(zhì)干細胞應(yīng)用于角膜疾病的研究進展

靳 娜，劉紅玲，張春梅，傅少穎

0 引言

角膜是視覺器官的一個重要組成部分，由于其所處解剖位置的特殊，很容易受到損傷，表現(xiàn)為角膜混濁、水腫、全層穿孔甚至失明等，嚴重威脅著患者的生活質(zhì)量，采取有效的治療措施控制角膜盲是全世界眼科領(lǐng)域所關(guān)注的重點。近年來，隨著干細胞科學的發(fā)展，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因具有免疫調(diào)控性強、有多向分化潛能、促進損傷修復(fù)能力強、易于獲得及性能穩(wěn)定等優(yōu)點，在各系統(tǒng)疾病均有廣泛地應(yīng)用［1－4］。BMSCs 在角膜疾病中的研究越來越受到眼科學者的重視，為復(fù)明事業(yè)的進一步發(fā)展帶來了希望。

1 BMSCs

1.1 BMSCs 概況近年來，BMSCs 的廣泛應(yīng)用引起了醫(yī)學界的關(guān)注。1987 年，F(xiàn)riedenstein 等［5］首次發(fā)現(xiàn)了BMSCs 的存在，BMSCs 是貼壁骨髓單核細胞，在一定條件下可分化為成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞和肌細胞，在擴增20 ～30 代后仍能保持其多向分化潛能。隨著科學技術(shù)及醫(yī)學事業(yè)的迅猛發(fā)展，BMSCs 得到了廣泛的臨床研究與應(yīng)用，在泌尿系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等學科都有研究［1－4］。BMSCs 在眼科疾病的研究也越來越多，包括常規(guī)方法難以治療的角膜疾病、視網(wǎng)膜疾病等［6－7］。

1.2 BMSCs 的生物學特性

1.2.1 BMSCs 的多向分化潛能 BMSCs 在合適的誘導(dǎo)條件下可以向多種細胞分化。Kale 等［1］通過將BMSCs 移植到腎小管，發(fā)現(xiàn)BMSCs 能夠定居于腎臟并分化為腎臟細胞，可顯著降低血清尿素氮水平，促進腎功能恢復(fù);Noel等［2］發(fā)現(xiàn)BMSCs 可以向成骨細胞分化，促進骨損傷修復(fù);方利君等［3］研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)面局部微環(huán)境的誘導(dǎo)下，BMSCs 具有向表皮細胞分化的潛能;BMSCs 還可以分化為心肌細胞等［4］;在眼科也有BMSCs 可以分化為視網(wǎng)膜細胞、類角膜上皮細胞的報道［8－9］。

1.2.2 BMSCs 的抗炎性 Thomas 等［10］發(fā)現(xiàn)將BMSCs 和自然殺傷細胞(NK)共同培養(yǎng)，比單獨培養(yǎng)的NK 多分泌了2.5 ～4 倍的具有抗炎作用的干擾素(INF)，證明了BMSCs 有抗炎作用;Brandau 等［11］發(fā)現(xiàn)BMSCs 通過促進中性粒細胞的抗微生物活性，起到抑制炎癥反應(yīng)的作用;Kehoe 等［12］通過將BMSCs 注入關(guān)節(jié)炎動物模型膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)，可以使軟骨缺失、炎性滲出、關(guān)節(jié)炎指數(shù)以及INF－α都明顯減少;Eliopoulos 等［13］在急性腎損傷動物模型中，通過腹腔注射BMSCs 的方法，明顯改善了腎臟功能，降低了炎癥因子的表達，證明BMSCs 可以通過控制炎癥促進腎小管恢復(fù)。

1.2.3 免疫調(diào)節(jié)性 BMSCs 具有免疫抑制性和非常低的免疫原性。Toll 受體(TLR)是免疫反應(yīng)中重要的中介物質(zhì)，可以增加BMSCs 的免疫抑制表型。Tomchuck 等［14］的研究表明BMSCs 可以表達TLR，經(jīng)TLR 刺激劑的刺激，下游信號(包括NF－κB、AKT 和MAPK)被激活，產(chǎn)生白細胞介素等一系列細胞因子，從而促進BMSCs 的免疫調(diào)節(jié)。Nicola 等［15］將T 淋巴細胞與BMSCs 混合培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，T淋巴細胞在受刺激時增殖能力被抑制，這種效果能被加入轉(zhuǎn)化細胞因子β1 或肝細胞生長因子的中和抗體所逆轉(zhuǎn)，說明這種抑制是由于BMSCs 的作用引起的;Jiang 等［16］發(fā)現(xiàn)與先天性免疫細胞相比，BMSCs 可以抑制樹突狀細胞(DC)的生成，減少人的白細胞抗原DR(HLA－DR)、CD80和CD86 的表達。

1.2.4 促進損傷修復(fù)性 當創(chuàng)傷發(fā)生時，BMSCs 可以使細胞再生，并且向受損的組織遷移，這使得BMSCs 可以通過促進細胞再生來治療嚴重損傷。Kim 等［17］表明BMSCs 不僅可以促進組織再生，還可以促進中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的功能恢復(fù);Qu 等［18］發(fā)現(xiàn)BMSCs 在鼠炎性腸疾病模型中可以向受損傷的腸組織遷移，并分化為腸黏膜細胞，表明BMSCs 可以促進損傷的腸黏膜修復(fù);Basiouny 等［19］在鼠全層皮膚損傷模型中，發(fā)現(xiàn)BMSCs 可以促進表皮、毛囊和真皮的再生，傷后第3wk，傷口出現(xiàn)表皮完全再生、膠原重組和VEGF 陽性細胞減少等跡象。

1.2.5 營養(yǎng)功能 隨著對BMSCs 研究的深入，許多學者認為BMSCs 的治療作用與其營養(yǎng)作用存在著密切的關(guān)系，并通過實驗研究證明了BMSCs 可以分泌多種營養(yǎng)因子，在神經(jīng)功能恢復(fù)等方面發(fā)揮了一定作用。Jeong 等［20］發(fā)現(xiàn)在缺血性腦卒中的動物模型中，BMSCs 不僅可以促進腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的分泌，而且本身可以分泌BDNF，在內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖和功能恢復(fù)方面均有作用。范東艷等［21］通過在體外共同培養(yǎng)活化的小膠質(zhì)細胞和BMSCs，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞活化刺激BMSCs 上調(diào)了膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的表達，使得多巴胺能神經(jīng)元免受毒素的損害，抑制了多巴胺能神經(jīng)元的延遲性死亡，說明BMSCs 可以通過釋放營養(yǎng)因子保護神經(jīng)細胞。

2 BMSCs 與角膜損傷及角膜移植排斥反應(yīng)

2.1 BMSCs 與角膜損傷角膜損傷可導(dǎo)致角膜炎癥、潰瘍、新生血管等病理改變。角膜緣干細胞的大量缺失引起角膜新生血管、角膜瘢痕形成;結(jié)膜上皮細胞的缺失使結(jié)膜分泌的黏蛋白減少，從而影響淚膜的形成，最終也會累及角膜;很多眼表問題的產(chǎn)生，都會造成角膜瘢痕的形成，甚至導(dǎo)致視力的喪失。這類眼部疾病的治療主要有抗炎、促進角膜修復(fù)、單純羊膜移植、板層角膜移植等，但因供體來源不足及異體移植引起排斥反應(yīng)而極度受限，所以尋找一種更有效的治療方法顯得尤為重要。隨著BMSCs 應(yīng)用的日益成熟，其在眼科的研究也越來越多。國內(nèi)外眼科學者的共同努力，闡明了BMSCs 在眼表疾病中角膜損傷中的作用。

2.1.1 抗炎抗新生血管 劉國華等［22］將堿燒傷大鼠模型用BMSCs 治療后發(fā)現(xiàn)，角膜新生血管和炎性細胞減少、透明度增加，成功重建了堿燒傷大鼠眼表;Roddy 等［23］研究表明BMSCs 靜脈注射或者腹腔注射后，可以分泌治療因子如TSG－6，減輕角膜受損后的混濁和炎癥反應(yīng);Yao等［24］研究發(fā)現(xiàn)結(jié)膜下注射BMSCs，可以抑制炎癥和抗血管生成，促進堿燒傷角膜的修復(fù);Joo 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs 作用于鼠化學傷模型中，通過增加IL－10 和TGF－1、IL－6、TSP－1，降低IL－2 和IFN－γ、CD4、MMP－2 炎癥相關(guān)因子的分泌，減少了角膜的炎癥和新生血管的發(fā)生。

2.1.2 分化為類角膜上皮 Jiang 等［25］發(fā)現(xiàn)BMSCs 可以被角膜基質(zhì)細胞誘導(dǎo)分化為類角膜上皮細胞，并且表達角膜上皮細胞表面標志CK12。將這種細胞移植于堿燒傷角膜，可以減輕角膜混濁、角膜熒光著色和新生血管，利于角膜損傷后的抗炎與角膜上皮重建;Park 等［26］發(fā)現(xiàn)BMSCs附著于羊膜表面，處于角膜細胞生長微環(huán)境中，BMSCs 可以直接分化為類角膜細胞;Gu 等［9］將BMSCs 移植到角膜化學傷模型，促進了受損角膜上皮愈合，表達了CK3，成功重建了損傷的角膜表面。本研究體外結(jié)果也表明，BMSCs可以迅速分化成與角膜上皮細胞的分子表型和形態(tài)相似的細胞。

2.1.3 歸巢作用 歸巢是指BMSCs 在多種因素的作用下趨向性遷移至靶組織(炎癥及損傷部位)并定植的過程。歸巢涉及的細胞因子及其受體、作用機制、信號傳導(dǎo)通路等機制較為復(fù)雜，現(xiàn)有研究表明趨化因子SDF－1 及其受體CXCR4 的相互作用始終貫穿于歸巢和植入過程，起著決定性作用［27］。有學者發(fā)現(xiàn)角膜損傷可以促進內(nèi)源性BMSCs 入血并到達角膜損傷處促進其愈合，說明BMSCs在角膜損傷時具有重要的參與修復(fù)作用［28］;Qiao 等［29］將BMSCs 注射到角膜緣堿燒傷動物模型中，激光共聚焦顯像鏡觀察到外源性BMSCs 遷移至損傷的角膜;Ye 等［30］制作堿燒傷動物模型，靜脈注射BMSCs 后發(fā)現(xiàn)，BMSCs 向損傷的角膜及角膜緣干細胞處遷移，促進堿燒傷角膜的愈合。2.2 BMSCs 與角膜移植排斥反應(yīng) 目前，各種嚴重影響視力的角膜疾病(如角膜白斑、圓錐角膜以及角膜潰瘍等)主要采取角膜移植的方法來治療。角膜移植可分為穿透性角膜移植、板層角膜移植、角膜上皮細胞移植等。角膜移植的成功率居器官移植的首位，但是由于角膜含有多種抗原，可以發(fā)生角膜移植排斥反應(yīng)。目前，治療角膜移植排斥反應(yīng)主要采用糖皮質(zhì)激素及環(huán)孢素A(CsA)等免疫抑制劑，但是耐藥性及長期使用的毒副作用又限制了這些藥物的應(yīng)用。BMSCs 以其優(yōu)良的生物學特性，在防治角膜移植排斥反應(yīng)中的作用越來越明朗。

2.2.1 免疫調(diào)節(jié)作用 1994 年P(guān)roekop［31］通過對自身免疫小鼠的骨髓移植實驗指出，BMSCs 不僅可以防止免疫移植失敗，而且可以在T、B 淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用;Oh 等［32］也證明將同種異體鼠角膜移植后，靜脈注射BMSCs 延長了角膜移植片的存活時間，免疫序列顯示，注射BMSCs 的鼠角膜，MHCII+細胞數(shù)量比對照組發(fā)生排斥反應(yīng)的數(shù)量明顯減少，表明BMSCs 可以通過抗早期的炎癥反應(yīng)和增加角膜表面抗原提呈細胞的活性來增加植片存活時間;Jia 等［33］的研究也表明，角膜移植術(shù)后注射BMSCs 可以延長植片的存活時間，BMSCs 抑制了T 細胞反應(yīng)，減少了術(shù)后Th1 炎性因子，增加了調(diào)節(jié)性T細胞;Treacy 等［34］研究也發(fā)現(xiàn)BMSCs 通過免疫調(diào)節(jié)作用，可以延長鼠同種異體角膜移植片的存活時間。

2.2.2 分化為類角膜細胞 施文建等［35］將第3 代BMSCs接種于去上皮的豬角膜基質(zhì)上，培養(yǎng)4d 后移植到廣泛損傷的兔角膜上。BMSCs 在豬角膜基質(zhì)上貼附、生長迅速，術(shù)后植片在植床上存活良好，無排斥反應(yīng)，角膜較對照組透明，新生血管少。實驗組角膜免疫組織化學及免疫熒光染色均檢測出CK12 陽性細胞，說明種植BMSCs 的豬角膜基質(zhì)移植到損傷兔角膜后可以存活，BMSCs 可以分化為角膜上皮樣細胞，具有構(gòu)建組織工程角膜的潛能;Takayama 等［36］通過綠色熒光蛋白示蹤法表明BMSCs 可以分化為兩種類型的類角膜細胞，一種是類角膜基質(zhì)細胞，一種是類角膜上皮細胞。

3 小結(jié)

綜上所述，由于BMSCs 具有多向分化潛能、抗炎、免疫抑制及促進損傷修復(fù)等作用，所以可以將其視為一種很有臨床應(yīng)用前景的種子細胞，但還有許多問題需要去解釋清楚。許多研究的結(jié)果都顯示，經(jīng)全身輸入的BMSCs 會不可避免地被肺部截留［37］，這也在一定程度上限制了靜脈注射的BMSCs 向其他部位的遷移效率。所以，利用BMSCs 靜脈輸入來進行細胞治療時必須要考慮BMSCs 的肺部截留問題。另外，進入眼內(nèi)的最佳、最安全的給藥方式還不確定，相信隨著細胞生物學、干細胞組織工程學和藥劑學等的發(fā)展，BMSCs 的研究也會得到進一步的突破，從而進入臨床造?；颊?。

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