人乳頭瘤病毒疫苗預(yù)防宮頸癌的應(yīng)用

夏巧凡，何蓮芝

宮頸癌是一種嚴(yán)重危害女性身心健康的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)病例約50萬(wàn)，死亡約25萬(wàn)例，其中約80%的病例出現(xiàn)在發(fā)展中國(guó)家[1]。隨著宮頸癌篩查制度的建立，其發(fā)病率和死亡率有所下降，但在一些發(fā)展中國(guó)家及地區(qū)宮頸癌仍是威脅婦女健康的重要疾病之一，且呈年輕化趨勢(shì)。宮頸癌的防治一直是世界各國(guó)尤其是發(fā)展中國(guó)家的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容之一，世界衛(wèi)生組織（WHO）也把宮頸癌的防治納入各國(guó)公共衛(wèi)生狀況考核內(nèi)容。20世紀(jì)80年代zur Hausen首次研究發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）與宮頸癌有關(guān)，現(xiàn)已明確持續(xù)性高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要因素[2]。目前人類(lèi)已研制出預(yù)防HPV感染的疫苗并通過(guò)臨床試驗(yàn)已在全球范圍內(nèi)推廣上市。通過(guò)接種疫苗、定期篩查、早診斷、早治療以及嚴(yán)密隨訪(fǎng)，宮頸癌有望成為人類(lèi)抗腫瘤史上第一個(gè)可以預(yù)防的癌癥。

1 HPV感染與宮頸癌的關(guān)系

1.1 HPV的生物學(xué)特征 HPV是一種嗜上皮性雙鏈環(huán)狀DNA病毒，由7800～7900個(gè)堿基對(duì)組成，是一種沒(méi)有包膜的病毒顆粒。其基因組按功能分為早期轉(zhuǎn)錄區(qū)（E區(qū)）、晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)（L區(qū)）和非編碼區(qū)。E區(qū)包括編碼 E1、E2、E4、E5、E6、E7 蛋白的開(kāi)放讀碼框（open reading frame，ORF），主要調(diào)控染色體外的DNA復(fù)制，表達(dá)于宮頸細(xì)胞的基底層、基底上層和中間層。E1在染色體復(fù)制過(guò)程中調(diào)節(jié)DNA的復(fù)制；E2在維持病毒基因游離形式和啟動(dòng)其轉(zhuǎn)錄中起重要作用；E4在整個(gè)上皮層均有表達(dá)，通過(guò)破壞細(xì)胞骨架使病毒顆粒從分化細(xì)胞中游離出來(lái)，促進(jìn)病毒顆粒的裝配和釋放，但E4的潛在功能仍有待進(jìn)一步研究；目前研究發(fā)現(xiàn)E5有修飾生長(zhǎng)因子受體的功能；E6和E7是病毒癌基因，在低危型HPV中不表達(dá)或弱表達(dá)，相反在高危型HPV中，一旦病毒基因組整合到宿主細(xì)胞基因組就進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯。E6與抑癌蛋白p53結(jié)合使細(xì)胞滯留在S期，阻礙細(xì)胞凋亡；E7與抑癌蛋白pRb結(jié)合，使其降解并誘導(dǎo)上皮組織惡性變[3]。L區(qū)包括編碼L1、L2蛋白的ORF，負(fù)責(zé)編碼衣殼蛋白，在頂端組織層才被激活進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。L1的基因序列具有高度保守性，編碼病毒的主要衣殼蛋白，具有在體外自我組裝成病毒樣顆粒（virus like particle，VLP）的特性，機(jī)體通過(guò)體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生對(duì)抗HPV VLP的中和抗體。L2編碼病毒的次要衣殼蛋白，大部分L2在殼內(nèi)，只有小部分暴露在表面。非編碼區(qū)主要通過(guò)控制ORF的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)病毒蛋白和病毒顆粒的產(chǎn)生。因此，L1蛋白成為第一代預(yù)防性HPV疫苗的靶分子，目前學(xué)者們已著手以L(fǎng)2蛋白為靶抗原進(jìn)行新一代HPV疫苗的研究。

1.2 HPV感染的致病機(jī)制 HPV通過(guò)機(jī)體的細(xì)微損傷與基底膜上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparin sulfate proteoglycan，HSPG）結(jié)合，HSPG屬于糖胺聚糖家族，具有組織特異性，在基底膜和基底細(xì)胞中均有表達(dá)，L1蛋白表面有HSPG受體結(jié)合位點(diǎn)。HPV與HSPG的相互作用導(dǎo)致病毒衣殼發(fā)生構(gòu)型變化，隨后弗林蛋白酶（Furin）裂解HPV的L2，使L1的細(xì)胞受體結(jié)合位點(diǎn)暴露，與此同時(shí)，病毒衣殼與HSPG之間的親和力減弱，經(jīng)此變化的HPV病毒顆粒從基底膜轉(zhuǎn)移到角質(zhì)細(xì)胞[4-5]。另有研究報(bào)道HPV最先感染基底細(xì)胞[6]，至于HPV最先感染基底膜還是基底細(xì)胞或HPV在兩者之間又存在怎樣的轉(zhuǎn)移機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。發(fā)生構(gòu)型變化的HPV病毒顆粒利用溶酶體相關(guān)膜蛋白（lysosome-associated membrane proteins）將病毒顆粒轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)體，然后病毒脫去衣殼，因其不能編碼聚合酶和HPV復(fù)制所需要的其他酶類(lèi)，在L2蛋白的輔助下感染的HPV基因組脫離核內(nèi)體，在有絲分裂期間借助微管移向細(xì)胞核，并與宿主細(xì)胞的基因組發(fā)生融合，在感染細(xì)胞的子代細(xì)胞內(nèi)復(fù)制蛋白的輔助下完成HPV基因組復(fù)制[4]。此外，HPV的生命周期還依賴(lài)上皮細(xì)胞的分化，只有在角質(zhì)細(xì)胞中HPV的晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)才開(kāi)始編碼L1和L2蛋白，進(jìn)入細(xì)胞核包裹HPV基因組，即完成HPV病毒顆粒的組裝。角質(zhì)層中可見(jiàn)典型的HPV相關(guān)細(xì)胞病理變化，如挖空細(xì)胞、核分裂相增多、細(xì)胞核增大。隨著上皮細(xì)胞的脫落，完成組裝的HPV病毒顆粒被釋放出來(lái)重新啟動(dòng)下一個(gè)感染周期[5]。

并非所有的HPV感染都導(dǎo)致細(xì)胞異常增生或惡性變。大多數(shù)HPV感染最終均能被機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞和體液免疫機(jī)制清除，大量體外試驗(yàn)檢測(cè)到宮頸癌細(xì)胞系中高危型HPV包含E6和E7基因在內(nèi)的基因與宿主細(xì)胞基因組發(fā)生整合并持續(xù)轉(zhuǎn)錄翻譯，表明HPV E6和E7基因中的1種或2種持續(xù)表達(dá)是高危型HPV感染致瘤的關(guān)鍵[7-8]。E6和E7蛋白分別通過(guò)與p53和pRb結(jié)合，導(dǎo)致p53、pRb功能失活降解，這一過(guò)程對(duì)于最終的癌性轉(zhuǎn)化是必要而非充分條件，但E6和E7蛋白附加的致癌性促進(jìn)宿主細(xì)胞無(wú)限增殖并向惡性轉(zhuǎn)化[9]。因此，E6和E7蛋白將成為今后HPV治療性疫苗的主要靶抗原。

2 預(yù)防性HPV疫苗的應(yīng)用研究

2.1 預(yù)防性HPV疫苗的類(lèi)型

2.1.1 已上市的預(yù)防性HPV疫苗 自2006年首批HPV疫苗上市以來(lái)已有2種HPV預(yù)防性疫苗被美國(guó)食品與藥品管理局（FDA）認(rèn)證上市，即針對(duì)HPV16/18型的二價(jià)疫苗Cervarix和針對(duì)HPV16/18/11/6型的四價(jià)疫苗Gardasil。目前上市的2種預(yù)防性HPV疫苗的抗原均是通過(guò)體外基因重組技術(shù)使L1蛋白在表達(dá)系統(tǒng)中自行包裝成與天然病毒類(lèi)似的類(lèi)病毒顆粒，這種重組的L1蛋白產(chǎn)生的VLP在形態(tài)上與HPV顆粒無(wú)區(qū)別，因所含的構(gòu)象表位相同，其抗原性與自然界中感染的HPV基本相似。但該種重組VLP不含有HPV DNA，故具有非感染性及非致癌性[10]。機(jī)體接種疫苗后，產(chǎn)生的抗體滴度是自然感染的20～80倍[6]，主要分布在血液和子宮黏膜的分泌液中，其可以阻止HPV附著在基底膜上[11]。2種疫苗均通過(guò)添加佐劑來(lái)增強(qiáng)其免疫效果，Gardasil中加入含鋁佐劑，Cervarix中加入含AS04佐劑，該佐劑是由細(xì)菌胞壁成分單磷酰脂質(zhì)A（monophosphoryl lipid A）構(gòu)成，兩者免疫途徑均為肌內(nèi)注射，前者需在第0，2，6個(gè)月各接種1次，后者接種時(shí)間是第0，1，6個(gè)月各接種1次。

2.1.2 新一代預(yù)防性HPV疫苗 新一代HPV預(yù)防性疫苗注重考慮疫苗的成本、持久性和廣譜免疫問(wèn)題。研究顯示在L2蛋白氨基酸的氨基末端有交叉中和表位，據(jù)此推測(cè)可利用單一抗原研制出廣譜免疫效應(yīng)的疫苗[12]。最近有研究者制備出一種能表達(dá)HPV16 L2蛋白的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），通過(guò)口服免疫誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生針對(duì)HPV16的中和抗體，同時(shí)可對(duì)HPV18，45和58也產(chǎn)生交叉免疫[13]。這可以解決已上市疫苗制備成本昂貴及廣譜免疫問(wèn)題，但是這些動(dòng)物模型產(chǎn)生的抗體滴度較弱，且無(wú)法進(jìn)一步研究HPV型別間的血清學(xué)反應(yīng)。然而利用HPV假病毒顆粒（HPV pseudovirion，PsV）可以使抗L2免疫原的抗血清有效中和不同的HPV型別[14]。此外，研究者們希望通過(guò)能表達(dá)L2的HPV L1-VLPs重組疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的交叉中和抗體，但目前的研究結(jié)果均不理想[5]。有研究也以L(fǎng)1衣殼為平臺(tái)嘗試制備出一種HPV16 L1△L2X3疫苗，盡管可以降低生產(chǎn)成本，但抗體濃度仍較低[15]。另有一項(xiàng)研究利用DNA重組技術(shù)將L2的部分區(qū)域表達(dá)于馬鈴薯X病毒（patato virus X，PVX）外殼蛋白中，該研究設(shè)計(jì)出來(lái)的L2108-120-PVX CP疫苗除了廉價(jià)、可進(jìn)行大批量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)外，更重要的是因?yàn)楸磉_(dá)的植物蛋白可以使疫苗免于病原物毒素的污染，以增加疫苗的安全性[16]。近年研究發(fā)現(xiàn)噬菌體PP7顆?？赡苁且环N潛在的內(nèi)源性佐劑，在激動(dòng)Toll樣受體中起重要作用，因此以噬菌體PP7為載體研制的L2-PP7混合疫苗顯示出很好的發(fā)展前景[17]。鑒于HPV主要通過(guò)黏膜組織侵犯機(jī)體，目前也開(kāi)始嘗試針對(duì)病毒的黏膜型抗體的研發(fā)[18]。

2.2 預(yù)防性HPV疫苗的適用對(duì)象 Gardasil疫苗最初適用于9～26歲的女性，主要用來(lái)預(yù)防HPV16或18感染引起的宮頸癌和HPV6或11導(dǎo)致的生殖器疣，后來(lái)被延伸用來(lái)預(yù)防外陰、陰道及肛門(mén)部位的癌癥，目前也推薦用于9～26歲的男性。Cervarix疫苗適用于10～25歲的女性，用于預(yù)防HPV16或18感染引起的宮頸癌或與此相關(guān)的癌前病變[19]。年齡的限制并不是絕對(duì)的，關(guān)鍵是有無(wú)性生活，HPV疫苗對(duì)于無(wú)性生活史的女性效果最佳。歐洲國(guó)家的一些流行病學(xué)資料顯示，HPV也可引起男性與多種HPV感染相關(guān)的良惡性腫瘤，包括肛門(mén)癌、陰莖癌、頭頸部腫瘤以及生殖器疣[20]。目前各界專(zhuān)家越來(lái)越支持對(duì)男性進(jìn)行HPV疫苗免疫[21-22]。由于沒(méi)有足夠的數(shù)據(jù)支持，目前并不推薦妊娠婦女接種HPV疫苗。

2.3 預(yù)防性HPV疫苗的有效性與安全性 從目前國(guó)外對(duì)上市后HPV疫苗效果的密切監(jiān)測(cè)結(jié)果來(lái)看，HPV疫苗對(duì)預(yù)防宮頸癌前病變及宮頸癌是安全有效的[23-24]。Cervarix疫苗由于含獨(dú)特佐劑，具有交叉免疫效應(yīng)，可以預(yù)防98%的宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變Ⅲ級(jí)（cervical intraepithelial neoplasiasⅢ，CINⅢ） 以及100%預(yù)防原位腺癌（adenocarcinoma in situ，AIS）[25]。Gardasil疫苗預(yù)防異性戀和同性戀男性的生殖器疣的有效率分別為92.4%和79%[26]，Gardasil疫苗還被證實(shí)可預(yù)防與HPV感染相關(guān)的外陰或陰道上皮內(nèi)瘤變[12]以及男性的高級(jí)別肛門(mén)疾病[27]。最新一項(xiàng)研究顯示，HPV疫苗除了能有效預(yù)防年輕女性患宮頸癌外，還能有效預(yù)防多種口咽部癌癥[10]。Gardasil疫苗和Cervarix疫苗的免疫保護(hù)期限分別是6.4年和8.4年[19]，2種HPV疫苗最常見(jiàn)的不良反應(yīng)是注射部位的局部炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重不良反應(yīng)包括格林-巴利綜合征（GBS）、暈厥、靜脈血栓等的發(fā)生率很低，且與安慰劑組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，目前暫無(wú)因注射2種疫苗而引起死亡的病例報(bào)道[28]。

3 預(yù)防性HPV疫苗的推廣和面臨的問(wèn)題

WHO正在積極推進(jìn)HPV疫苗全球接種計(jì)劃的實(shí)施，但目前研制出的HPV預(yù)防性疫苗具有型別特異性，隨著其在世界范圍內(nèi)推廣使用，會(huì)凸顯其他型別HPV感染引起的宮頸癌的發(fā)生。研發(fā)更多價(jià)數(shù)的HPV疫苗是將其納入免疫計(jì)劃中不可忽視的問(wèn)題之一。目前HPV疫苗的費(fèi)用大約在2000～3000元，其高昂的費(fèi)用對(duì)宮頸癌負(fù)擔(dān)很重的發(fā)展中國(guó)家來(lái)說(shuō)無(wú)疑是推廣的一大障礙。因此，新一代HPV疫苗主要致力于研發(fā)廣譜、廉價(jià)、高效的疫苗，從源頭預(yù)防宮頸癌，同時(shí)為與HPV感染有關(guān)的其他癌癥的預(yù)防奠定基礎(chǔ)。

目前中國(guó)HPV疫苗尚處于臨床試驗(yàn)階段，影響HPV疫苗遲遲在中國(guó)應(yīng)用的原因除了經(jīng)濟(jì)因素，還有如何選擇科學(xué)合理的臨床終點(diǎn)以加速疫苗預(yù)防效果的評(píng)估。目前各界專(zhuān)家對(duì)持續(xù)性HPV感染作為終點(diǎn)來(lái)評(píng)價(jià)HPV預(yù)防性疫苗臨床試驗(yàn)的有效性已達(dá)成共識(shí)。希望這能加速HPV疫苗在中國(guó)的上市進(jìn)程，使中國(guó)女性早日享受到這一人類(lèi)科學(xué)進(jìn)步的成果。

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