過(guò)敏性哮喘患兒血漿IFN－γ與IL－4及糞便雙歧桿菌檢測(cè)及分析＊

張 紅，顧 猛

（1.常州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 213001；2.常州市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 213003）

過(guò)敏性哮喘患兒血漿IFN－γ與IL－4及糞便雙歧桿菌檢測(cè)及分析＊

張 紅1，顧 猛2△

（1.常州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 213001；2.常州市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 213003）

目的探討輔助T淋巴細(xì)胞（Th）亞群Th1/Th2平衡及腸道正常菌群在兒童過(guò)敏性哮喘發(fā)病中的意義，為臨床通過(guò)益生菌的早期干預(yù)來(lái)糾正Th1/Th2平衡提供理論依據(jù)。方法ELISA檢測(cè)165例小兒過(guò)敏性哮喘患兒（哮喘組）及同期進(jìn)行健康體檢且合格的150例兒童（對(duì)照組）的血清IFN－γ與IL－4水平，同時(shí)，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)糞便中雙歧桿菌的數(shù)量。在應(yīng)用雙歧桿菌制劑調(diào)節(jié)腸道菌群6個(gè)月后再次檢測(cè)上述指標(biāo)，結(jié)合臨床相關(guān)檢查資料，對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果哮喘組初入院時(shí)血漿IFN－γ低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IL－4的水平高于對(duì)照組，糞便中雙歧桿菌數(shù)量少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)過(guò)6個(gè)月的益生菌制劑的調(diào)理，哮喘組血漿IFN－γ水平升高，IL－4水平則下降，糞便中雙歧桿菌的數(shù)量增多，與初入院時(shí)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論在兒童哮喘患兒中，腸道菌群的平衡關(guān)系到其免疫是否平衡，兩者相互影響，臨床應(yīng)早期進(jìn)行干預(yù)調(diào)節(jié)腸道菌群和免疫平衡。

過(guò)敏性哮喘； 雙歧桿菌； 干擾素－γ； 白細(xì)胞介素－4

小兒支氣管哮喘是一種由干擾素－γ（IFN－γ）、白細(xì)胞介素（IL）－4等多種細(xì)胞因子參與，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性咳嗽、喘鳴和呼吸困難，并伴有氣道高反應(yīng)性的可逆的、梗阻性呼吸道疾病，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，近年來(lái)的研究表明Th1、Th2的失衡是哮喘發(fā)病的重要機(jī)制［1－2］。Th1/Th2功能平衡與否與小兒過(guò)敏性哮喘的輕重及轉(zhuǎn)歸有著直接的關(guān)系。但檢索文獻(xiàn)甚少發(fā)現(xiàn)有關(guān)調(diào)理機(jī)體免疫功能與Th1/Th2功能相關(guān)性的探討。本研究通過(guò)檢測(cè)過(guò)敏性哮喘患兒血漿中IFN－γ與IL－4及同期糞便中雙歧桿菌的數(shù)量，從免疫學(xué)和腸道微環(huán)境平衡的角度來(lái)探索Th1/Th2及腸道正常菌群在過(guò)敏性哮喘中的發(fā)病機(jī)制及臨床價(jià)值，為臨床通過(guò)益生菌的早期干預(yù)來(lái)糾正Th1/Th2平衡提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年6月至2013年11月在本院門(mén)診及兒童醫(yī)院門(mén)診治療的小兒支氣管哮喘患者165例，年齡1～13歲，平均6.2歲，其中男94例，女71例。除此之外，隨機(jī)選取同期幼兒園和小學(xué)生健康體檢兒童150例為對(duì)照組，無(wú)哮喘病及過(guò)敏史，采血前1個(gè)月內(nèi)無(wú)感染及用藥史。兩組年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 治療方法 補(bǔ)充益生菌。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本處理 患兒于初次入院和補(bǔ)充益生菌6個(gè)月后留取外周靜脈血標(biāo)本，對(duì)照組正常體檢時(shí)留取標(biāo)本。所有標(biāo)本留取后離心提取血清，－70℃保存?zhèn)溆?。在留取血液?biāo)本的同時(shí)留取其糞便標(biāo)本（復(fù)診前停止服用益生菌制劑）。

1.3.2 IFN－γ和IL－4測(cè)定 采用ELISA法，試劑盒由美國(guó)RD公司提供，檢驗(yàn)程序嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，為確保檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和可比性，所有樣本各項(xiàng)目所用的試劑均為同一批次和同時(shí)檢測(cè)。

1.3.3 糞便雙歧桿菌的檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)糞便中雙歧桿菌的數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行資料的輸入和統(tǒng)計(jì)分析，雙歧桿菌數(shù)量不呈正態(tài)分布，但取對(duì)數(shù)后數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t或t′檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

哮喘組患兒初次入院時(shí)及治療6個(gè)月后血漿中IFN－γ、IL－4水平、糞便中雙歧桿菌的數(shù)量與對(duì)照組比較，IFN－γ水平及雙歧桿菌的數(shù)量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IL－4水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。哮喘組患兒補(bǔ)充益生菌治療6個(gè)月后血漿IFN－γ、IL－4水平及同期糞便中雙歧桿菌的數(shù)量與初次入院時(shí)比較，IFN－γ水平及雙歧桿菌的數(shù)量均有增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IL－4水平則下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；基本恢復(fù)到健康兒童水平，與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

3 討 論

哮喘是主要由Th亞群Th1/Th2細(xì)胞比例和功能失衡所引起的免疫反應(yīng)，主要表現(xiàn)為T(mén)h2細(xì)胞功能亢進(jìn)，如IL－3、IL－4、IL－5等細(xì)胞因子分泌增多，而IFN－γ、IL－2等Th1細(xì)胞因子分泌減少，致Th1/Th2比例失衡［3］。IL－4、IL－5等Th2細(xì)胞因子增多可導(dǎo)致氣道局部慢性炎癥，產(chǎn)生氣道高反應(yīng)性而致哮喘。IL－4即B細(xì)胞生長(zhǎng)因子，主要作用于B細(xì)胞，是IgE特異性誘導(dǎo)劑，能增強(qiáng)IgE介導(dǎo)的體液免疫和殺傷細(xì)胞的殺傷能力。IL－4作為B細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化因子，參與B細(xì)胞增殖及對(duì)抗原刺激的應(yīng)答產(chǎn)生抗體的過(guò)程，可以促進(jìn)IgE的合成和釋放，同時(shí)它也是氣道高反應(yīng)的必需因子，在氣道變應(yīng)性炎癥形成過(guò)程中主要起著使嗜酸性粒細(xì)胞募集、趨化和浸潤(rùn)的作用，并且能夠抑制Th1細(xì)胞分泌IFN－γ，在Ⅰ型速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，參與變應(yīng)性炎癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。IFN－γ是一種對(duì)細(xì)胞功能具有調(diào)節(jié)作用的小分子多肽，由活化的Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，可抑制B細(xì)胞產(chǎn)生IgE、IgG1和IgG4，在哮喘發(fā)病中具有至關(guān)重要的作用。而IFN－γ本身也能促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞的分化；IFN－γ抑制氣道黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞的聚集和活化；IFN－γ是IL－4的拮抗因子，通過(guò)抑制IL－4mRNA轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制B細(xì)胞表達(dá)低親和IgE受體，從而抑制B細(xì)胞增殖及分泌抗體［4］。

哮喘組治療前IFN－γ水平明顯低于對(duì)照組，而IL－4水平則明顯高于對(duì)照組，且與患兒病情嚴(yán)重程度相關(guān)，病情越重，IFN－γ水平越低。而IL－4水平越高，說(shuō)明IFN－γ及IL－4在過(guò)敏性哮喘發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，Th1/Th2失衡與哮喘發(fā)病有關(guān)。這說(shuō)明以IL－4為代表的Th2類(lèi)細(xì)胞因子參與了Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，促進(jìn)了IgE的合成和釋放，而以IFN－γ為代表的Th1細(xì)胞因子通過(guò)對(duì)IL－4的拮抗來(lái)抑制B細(xì)胞分泌抗體。經(jīng)過(guò)6個(gè)月的治療后，Th1/Th2細(xì)胞比例有了很大的改善，而患兒的臨床癥狀也得到較大的改善，從而也進(jìn)一步證實(shí)了哮喘是由Th1/Th2細(xì)胞比例和功能失衡所引起的一種免疫反應(yīng)。

腸道作為人體最大的免疫器官，自出生就暴露于大量的微生物抗原和食物抗原之下，在其刺激下，腸黏膜淋巴細(xì)胞被激活，達(dá)到全身免疫的效果，一旦菌群失調(diào)則可以導(dǎo)致機(jī)體體液免疫、細(xì)胞免疫以及非特異性免疫功能降低［5－7］。本研究腸道正常菌群對(duì)免疫系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要，一旦腸道發(fā)生菌群失調(diào)，將導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞比例失衡，機(jī)體的免疫力將明顯下降，提示臨床上避免濫用抗菌藥物和重視益生菌的補(bǔ)充。益生菌通過(guò)誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，抑制Th2型免疫反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)Th1和Th2的調(diào)節(jié)，使宿主的免疫應(yīng)答或免疫耐受達(dá)到精細(xì)的平衡，從而達(dá)到維持宿主健康的最終目的。

綜上所述，過(guò)敏性哮喘患兒存在著明顯的免疫失衡問(wèn)題，IFN－γ與IL－4是一對(duì)相互拮抗的細(xì)胞因子，兩者均參與了IgE的調(diào)節(jié)，具有協(xié)同作用，從而導(dǎo)致Th1/Th2平衡失調(diào)，這可能是導(dǎo)致小兒哮喘的主要原因之一。過(guò)敏性哮喘患兒糞便中雙歧桿菌數(shù)量明顯下降，說(shuō)明患兒存在腸道菌群的紊亂，通過(guò)雙歧桿菌制劑的調(diào)理，血漿IFN－γ水平上升，而IL－4水平下降，Th1/Th2比例趨于平衡，說(shuō)明哮喘發(fā)作時(shí)，腸道菌群是否平衡關(guān)系到其免疫是否平衡，兩者相互影響。本研究可以為臨床早期使用益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群和免疫平衡，以期達(dá)到預(yù)防哮喘的目的，提供理論支撐。

［1］Verhulst SL，Vael C，Beunckens C，et al.A longitudinal analysis on the association between antibiotic use，intestinal microflora，and wheezing during the first year of Life［J］.J Asthma，2008，45（9）：828－832.

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The determination of plasma IFN－γand IL－4 and fecal bifidobacteria in children with allergic asthma and analysis＊

Zhang Hong1，Gu Meng2△
（1.Department of Clinical Laboratory，Changzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Changzhou，Jiangsu213001， China；2.Department of Clinical Laboratory，Changzhou Children′s Hospital，Changzhou，Jiangsu213003，China）

ObjectiveTo explore the pathogenesis and clinical value of Th1/Th2and normal intestinal flora from the angle of immunological and intestinal micro environment balance by detecting the plasma interferon－γ（IFN－γ）and interleukin－4（IL－4）and fecal bifidobacteria in Children with Allergic Asthma，so as to provide a theoretical basis through early intervention of probiotics to correct the Th1/Th2balance.MethodsThe levels of blood plasma IFN－γ，IL－4and fecal bifidobacteria amount of 165cases of children with allergic asthma and 150health students as control group were detected by ELISA and real time fluorescence PCR at the same time.Retesting these above indexes after applying bifidobacteria regulation of intestinal flora for 6months.The clinical relative factors and experimental data were statistically analyzed.ResultsThe level of IFN－γof asthmatic children were remarkably lower than those in the control group（P＜0.05），while the level of IL－4of asthmatic children were remarkably higher than those in the control group（P＜0.05），and the amount of bifidobacteria of asthmatic children were remarkably lower than those in the control group（P＜0.05）.The level of IFN－γand bifidobacteria of asthmatic children improved remarkably and the level of IL－4decreased significantly after applying bifidobacteria regulation of intestinal flora for 6months.All of them had remarkable statistically significant.ConclusionThe immune balance was affected by the intestinal flora balance of vice versa.This would provide an important theoretical support to prevent the occurrence of allergic asthma by the early probiotics regulation of intestinal flora and immune balance.

allergic asthma； bifidobacteria； interferon－γ； interleukin－4

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.034

A

1673－4130（2015）03－0367－03

2014－11－08）

南通市科技基金資助項(xiàng)目（HS2011060）。 作者簡(jiǎn)介：張紅，女，副主任技師，主要從事臨床檢驗(yàn)基礎(chǔ)的研究?！?/p>

，E－mail：932335114＠qq.com。