轉(zhuǎn)鐵蛋白水平與男性生育及睪丸足細胞功能的關(guān)系

楊 錚，黃 萍，彭道榮，鄭善鑾，張小寧，王 菁

（第四軍醫(yī)大學(xué)：1.學(xué)員旅；2.秦都口腔醫(yī)院檢驗科；3.西京醫(yī)院全軍臨床檢驗醫(yī)學(xué)研究所，陜西 西安 710032）

轉(zhuǎn)鐵蛋白水平與男性生育及睪丸足細胞功能的關(guān)系

楊 錚1，黃 萍2△#，彭道榮3，鄭善鑾3，張小寧3，王 菁3

（第四軍醫(yī)大學(xué)：1.學(xué)員旅；2.秦都口腔醫(yī)院檢驗科；3.西京醫(yī)院全軍臨床檢驗醫(yī)學(xué)研究所，陜西 西安 710032）

目的探討轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）水平與男性生育及睪丸足細胞功能的關(guān)系。方法收集臨床男性不育癥患者和正常生育者的精液標本，采用精子質(zhì)量分析儀進行精子密度及活動率分析，并檢測精液Tf水平；無菌切取大鼠睪丸，經(jīng)膠原酶及透明質(zhì)酸酶消化，分離出純度較高的足細胞并培養(yǎng)，測定細胞培養(yǎng)液Tf水平；Tf水平測定均采用免疫速率散射比濁法。結(jié)果男性不育癥患者精液Tf水平［（15±5）μmol/L］低于正常生育者［（24.5±6.5）μmol/L，P＜0.01］，而且與精子密度和活動率呈正相關(guān)（P＜0.01）。正常生育組大鼠睪丸足細胞懸液Tf水平［（25±8）μmol/L］高于不育組［（15±6）μmol/L，P＜0.01］。結(jié)論精液Tf水平的測定可作為反映足細胞功能，評價曲細精管生精功能及精子質(zhì)量的指標，對男性不育癥的診斷、治療具有重要的價值。

精液； 轉(zhuǎn)鐵蛋白； 足細胞； 男性不育癥

睪丸足細胞核均勻地分布在小鼠曲細精管中，而足細胞質(zhì)與細胞膜以玫瑰花型與曲細精管基底部的干細胞相連，對生殖細胞起營養(yǎng)、支持及保護作用，能分泌多種物質(zhì)參與生殖過程。目前已知大鼠和人睪丸轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）是足細胞合成的主要蛋白，對促卵泡激素及睪酮等調(diào)節(jié)精子發(fā)生的激素調(diào)控起重要作用，鐵的轉(zhuǎn)運可能是足細胞的一種重要功能且與精子發(fā)生的激素調(diào)控有關(guān)。目前，只有精液中雄激素結(jié)合蛋白（ABP）的水平可以作為反映足細胞功能的特異性指標，但測定ABP繁瑣費時，其在精液中的水平很低。有學(xué)者認為Tf水平可作為判斷睪丸足細胞功能的指標，對了解睪丸曲細精管內(nèi)的生精細胞有重要價值［1－2］。為此，筆者對臨床140例精液樣品中的Tf水平及精子活力、密度等進行了檢測，分析了其與男性生育的關(guān)系，并對大鼠睪丸足細胞Tf分泌進行了初步研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取于西京醫(yī)院泌尿外科、中醫(yī)科門診就診的男性不育癥患者110例作為不育組，納入者均已婚并同居2年以上，性生活正常，排除女方不孕原因，年齡22～28（24±3）歲；另外選取有生育能力且自愿獻精的男性30例作為正常生育組，年齡21～28歲，平均（24±3）歲。

1.2 試劑與儀器 試劑和耗材主要有DMEM－Ham′sF12培養(yǎng)液（美國Sigma公司生產(chǎn)），253U/mg的Ⅱ型膠原酶，890 U/mg透明質(zhì)酸酶，10cm×10cm培養(yǎng)皿和24孔培養(yǎng)板（北京知麟堂生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)）；主要儀器包括SQA－V全自動精子質(zhì)量分析儀（以色列產(chǎn)）；貝克曼Array360特種蛋白分析儀（美國產(chǎn)）。

1.3 方法

1.3.1 精液采集 所有受試者禁欲3～5d，用新潔爾滅消毒手及尿道口，以手淫法獲取1次全部精液，放入一次性無菌干燥帶蓋塑料容器內(nèi)，置37℃恒溫水浴箱中，孵育30min，待完全液化后，進行精液分析及Tf水平測定。

1.3.2 精液分析 取液化的精液，參照WHO標準［3］，于SQA－V全自動精子質(zhì)量分析儀檢測。然后將不育男性按精子密度不同分為：無精子、＜2×1010/L、（2～4）×1010/L和＞4× 1010/L組共4組，各組分別為20、28、33、29例；按精子活動率分為：無活動力、＜20%、20%～40%和＞40%組，4組分別為21、30、30、29例；生育男性精子密度為（5～10）×1010/L，精子活動率為60%～90%，同時測定其各組精液Tf水平。

1.3.3 各組精液標本Tf水平的檢測 采用聚乙烯二醇（PEG）兔抗人Tf血清與待測精液結(jié)合，使精液中的Tf發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)，形成極細的乳白色抗原抗體復(fù)合物顆粒，懸浮于溶液中，利用散射比濁原理，與標準濃度管相比較，求得精液中的Tf水平。具體操作步驟：取精液50μL，加入20 mmol/L PBS 450μL（1∶9稀釋），混勻，于美國貝克曼Array360特定蛋白分析儀上選用尿液Tf測定應(yīng)用程序，雙管平行測定。

1.3.4 足細胞的分離、培養(yǎng)及實驗 參照文獻［4］取20d日齡，體質(zhì)量約40g的雄性大鼠13只（第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供），作為正常生育組。頸椎脫臼處死，無菌切取睪丸，用培養(yǎng)液沖洗3次，剝?nèi)グ啄ぃ羲榉湃朐嚬苤?，每只加?58.37 nkat膠原酶和13.17nkat的透明質(zhì)酸酶，37℃水浴震蕩，消化15min，每隔5min用吸管輕輕吹打一次，然后靜置5min；棄上層細胞懸液，剩下的細胞用培養(yǎng)液洗3次，每次1 500r/min離心10min。然后每只加入31.67nkat膠原酶和2.67nkat透明質(zhì)酸酶，37℃水浴震蕩，消化40min，每5min用吸管輕輕吹打一次；200目濾網(wǎng)過濾，濾液靜置5min，去除部分漂浮細胞，1 500r/min離心10min×3次備用。經(jīng)24h培養(yǎng)在倒置顯微鏡下觀察細胞完全貼壁，呈多角形或梭形展開，多數(shù)細胞連成片，為典型的足細胞，細胞純度高達93%以上，與文獻［4］基本相同。取足細胞懸液，調(diào)細胞濃度為8×105/mL，加入24孔培養(yǎng)板中，置37℃孵箱48h后，測定上清液中的Tf水平。再選雄性大鼠13只采用腺嘌呤500mg/kg灌胃15d制作大鼠不育動物模型［5］作為不育組按上述方法分離、培養(yǎng)足細胞，測定細胞上清液中的Tf水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同精子密度組Tf水平的測定 正常生育組精液Tf水平與精子密度呈正相關(guān)（r＝0.91，P＜0.01），不育組各組（無精子、＜2×1010/L、（2～4）×1010/L和＞4×1010/L組）的精子密度與Tf呈正相關(guān)（r分別為0.45、0.69、0.73、0.89，P＜0.01），不育各精子密度組Tf水平隨精子密度增加而上升，見表1。

表1 精子密度與精液Tf水平間的關(guān)系（）

＊：P＜0.01，與正常生育組比較。

組別 精子密度 n 精液Tf（μmol/L）L 30 25±6不育組 無精子 20 10±3＊＜2×1010/L 28 13±4＊（2～4）×1010/L 33 16±6＊＞4×1010/L 29 19±7正常生育組 （5～10）×1010/＊

2.2 不同精子活動率組Tf水平的測定 正常生育組和不育組各亞組（按精子活動率分為：無活動力、＜20%、20%～40%和＞40%組）精子活動率與精液Tf水平呈正相關(guān)（r分別為0.96、0.46、0.67、0.73、0.88，P＜0.01），不育組各亞組Tf水平隨精子活動率增加而上升，見表2。

2.3 大鼠睪丸足細胞分泌Tf的水平與生育的關(guān)系 正常生育組大鼠睪丸足細胞細胞懸液中Tf的水平［（25±8）μmol/L］明顯高于不育組大鼠睪丸足細胞細胞懸液［（15±6）μmol/L］，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 不同精子活動率與Tf水平間的關(guān)系（）

＊：P＜0.01，與正常生育組比較。

組別 精子活動率 n 精液Tf（μmol/L）正常生育組 60%～90% 30 24±7不育組 無活動力 21 11±2＊＜20% 30 14±4＊20%～40% 30 16±5＊＞40% 29 19±6＊

3 討 論

睪丸足細胞在精子發(fā)生過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是曲精小管中唯一的非生殖細胞，不僅對生殖細胞發(fā)育起支持和營養(yǎng)作用，而且通過形成血－睪屏障決定并保持睪丸液的組分，還能傳遞支配精子發(fā)生的激素信號。足細胞能分泌多種對精子發(fā)生起重要作用的蛋白質(zhì)，Tf就是睪丸足細胞產(chǎn)生和分泌的，Tf是由β1球蛋白與血中細胞生長的基本因子－－鐵離子結(jié)合的一種復(fù)合體，是通過足細胞膜上Tf受體，以Tf的形式將鐵儲存于足細胞內(nèi)，足細胞以頂端分泌的形式將鐵傳送給曲細精管生殖上皮上的不同發(fā)育時期的生精細胞，以促進生殖細胞的生長發(fā)育、成熟及釋放過程起關(guān)鍵性的作用［6－8］。精液中80%的Tf是由足細胞分泌，Tf的主要功能為鐵的轉(zhuǎn)運載體，睪丸足細胞功能缺陷都會影響Tf的分泌導(dǎo)致精子的發(fā)生障礙，而影響生育能力，Tf水平的高低是反應(yīng)足細胞功能的特定性標志［4］。當精液中Tf水平減少可直接影響精子細胞的形成和釋放。Tf水平和精子總數(shù)呈正相關(guān)［9－10］。本研究顯示，精液Tf水平與精子密度、活動率存在相關(guān)性，不育各組精液Tf水平隨精子密度及活動率減低而下降，與正常生育組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），這說明精液Tf對精子的生長、發(fā)育、排放發(fā)揮著重要的作用。正常生育大鼠足細胞培養(yǎng)上清液Tf水平明顯高于不育組（P＜0.01），這也說明了Tf水平測定對男性不育癥有重要的診斷價值。

精子的順利產(chǎn)生必須以足細胞功能正常為前提，而足細胞的功能則通過它所表達或分泌的各類蛋白來執(zhí)行，蛋白的數(shù)量、構(gòu)象發(fā)生改變會影響足細胞的功能。Tf水平是反映睪丸足細胞功能的指標之一，是評價曲細精管生精狀態(tài)的一種特異性指標。精子的生成、成熟、運輸及附性腺異常導(dǎo)致的精液和精子異常是男性不育癥的最常見原因。臨床上少精子癥與弱精子癥導(dǎo)致的男性不育癥約占70%，精子數(shù)量、質(zhì)量的變化是判斷男性生育力的重要依據(jù)。由于Tf水平與精子密度、數(shù)量、質(zhì)量呈正相關(guān)，所以檢測精液中Tf水平對男性不育癥的診斷和治療具有一定的指導(dǎo)意義。

［1］Nel－Themaat L，Jang CW，Stewart MD，et al.Sertoli cell behaviors in developing testis cords and postnatal seminiferous tubules of the mouse［J］.Biol Reprod，2011，84（2）：342－350.

［2］ 劉民，羅蘭.睪丸支持細胞功能的研究進展［J］.實驗動物科學(xué)，2012，29（1）：52－56.

［3］ 楊麥貴，張竹映，鄭善鑾，等.一氧化氮與白細胞精子癥不育的關(guān)系探討［J］.細胞與分子免疫學(xué)雜志，2002，18（6）：634－636.

［4］ 楊潤軍，李青旺，許尚忠，等.小鼠睪丸支持細胞分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性鑒定［J］.中國畜牧雜志，2008，44（9）：17－20.

［5］ 俞錚錚，馮磊.腺嘌呤用于制作雄性大鼠不育癥模型理想劑量和時效關(guān)系的研究［J］.浙江醫(yī)學(xué)，2008，30（12）：1316－1318.

［6］ 閆玉華，張永良.人精漿中蛋白質(zhì)檢測進展［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2003，11（3）：13－14.

［7］Barthelemy C，Khalfoun B，Guillaumin JM，et al.Seminal fluid transferrin as an index of gonadal function in men［J］.J Reprod Fertil，1998，82（1）：113－118.

［8］Rato L，Socorro S，Cavaco JE，et al.Tubular fluid secretion in the seminiferous epithelium：ion transporters and aquaporins in Sertoli cells［J］.J Membr Biol，2010，236（2）：215－224.

［9］Orlando C，Caldini AL，Barni T，et al.Ceruloplasmin and transferrin in human seminal plasma：are they an index of seminiferous tubular function［J］.Fertil Steril，1995，43（2）：290－294.

［10］Liu DY，Cooper EJ，Baker HW.Seminal transferrin，an index of Sertoli cell function：is it of clinical value［J］.Clin Reprod Fertil，1986，4（3）：191－197.

Relationship between transferrin levels and function of male fertility and testicular podocyte

Yang Zheng1，Huang Ping2△#，Peng Daorong3，Zheng Shanluan3，Zhang Xiaoning3，Wang Jing3
（1.Student Brigade；2.Department of Clinical Laboratory，Qindu Stomatology Hospital；3.Clinical Laboratory Institute of PLA，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi′an，Shaanxi，710032）

ObjectiveTo investigate the relationship between levels of transferring（Tf）and function of male fertility and testicular podocyte.MethodsSemen samples from male patients with infertility and volunteers with normal infertility were collected and tested for sperm density and motility by using sperm quality analyzer.In additon to that，Tf concentrations of Tf were determined；aseptically excised rat testis and by collagenase and hyaluronidase digestion，podocytes were isolated with high purity and cultured in culture medium，then the concentration of Tf in cell culture medium was determined；Tf concentration were determined by rate nephelometry.ResultsTf concentration in semen of male－infertility patients［（15±5）μmol/L］was significantly lower than that of normal－fertility volunteers［（24.5±6.5）μmol/L，P＜0.01］，which were positively correlated sperm count and motility（P＜0.01）.Tf concentrations of cell culture medium［（25±8）μmol/L］in which testicular podocytes were cultured were significantly higher than that of infertile rat［（15±6）μmol/L，P＜0.01］.ConclusionDetermination of semen Tf levels can reflect podocyte function and be used as an indicator for the evaluation of seminiferous tubules spermatogenesis，which was valuable in the diagnosis and treatment of male infertility.

semen； transferrin； podocyte； male infertility

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.021

A

1673－4130（2015）03－0336－03

2013－11－18）

楊錚，女，在讀本科生，主要從事從事醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究。#共同第一作者。△

，E－mail：huangping＠fmmu.edu.cn。