貴州省漢族人群類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者TRAF1/C5基因多態(tài)性研究＊

梁愛(ài)鳳，費(fèi) 櫻

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院檢驗(yàn)科，上海 201700；2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院微生物免疫科，貴州 貴陽(yáng) 550004）

貴州省漢族人群類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者TRAF1/C5基因多態(tài)性研究＊

梁愛(ài)鳳1，費(fèi) 櫻2△

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院檢驗(yàn)科，上海 201700；2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院微生物免疫科，貴州 貴陽(yáng) 550004）

目的探討腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子1（TRAF1）/補(bǔ)體5（C5）單核苷酸多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的相關(guān)性。方法提取300例RA患者（RA組）和300例健康者DNA（對(duì)照組），實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)TRAF1/C5基因rs3761847和rs10818488的單核苷酸多態(tài)性。結(jié)果TRAF1/C5存在基因多態(tài)性，但RA組與對(duì)照組比較基因多態(tài)性位點(diǎn)的單倍體基因型和等位基因頻率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)rs3761847與rs10818488之間存在強(qiáng)連鎖不平衡。rs3761847位點(diǎn)A等位基因與類風(fēng)濕因子（RF）陰性（P＝0.001，OR＝0.57，95%CI：0.41～0.79），抗CCP抗體（抗－CCP）陰性（P＝0.001，OR＝0.51，95%CI：0.35～0.76）及抗Sa抗體陰性均相關(guān)（P＝0.02，OR＝0.72，95%CI：0.55～0.94）；rs10818488位點(diǎn)G等位基因僅與RF陽(yáng)性相關(guān)（P＝0.01，OR＝1.40，95%CI：1.09～1.81）。結(jié)論TRAF1/C5基因多態(tài)性可能與貴州漢族人群RA的遺傳易感性無(wú)關(guān)。

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子； 補(bǔ)體； 單核苷酸多態(tài)性； 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，其病因尚不明確，遺傳、環(huán)境和免疫因素共同發(fā)揮作用。RA作為一種多基因遺傳疾病，目前已知的RA易感基因主要有腫瘤壞死因子（TNF）、人類白細(xì)胞抗原（HLA）－DR、白細(xì)胞介素（IL）及肽?；彼崦搧啺访福?（PADI4）等。已有報(bào)道表明位于9號(hào)染色體短臂33－34位點(diǎn)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF1）/補(bǔ)體5（C5）基因是RA的易感基因，且與抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體陽(yáng)性相關(guān)［1］，而后者是RA早期診斷、病情評(píng)估和療效檢測(cè)的有效指標(biāo)之一。RA的遺傳異質(zhì)性使得不同人種之間的遺傳學(xué)研究結(jié)果常不一致。本研究首次以貴州漢族人群為研究對(duì)象，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real－time PCR）方法檢測(cè)TRAF1/C5基因多態(tài)性，并探討該基因與RA患者相關(guān)血清學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系，旨在探討該基因與貴州漢族人群RA患者遺傳易感性之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年10月至2013年1月貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科門診及病房的300例RA患者全血，均為漢族，其中男性72例、女性228例，平均年齡（50.3±14.6）歲，所有RA病例均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）和歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟（RULAR）2010年聯(lián)合推出的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］；按照民族、年齡和性別匹配的原則選取健康體檢者300例作為對(duì)照組，其中男性66例，女性234例，平均年齡（50.5±14.1）歲，均排除其他自身免疫性疾病及腫瘤等。所有納入對(duì)象均為無(wú)血緣關(guān)系的個(gè)體。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 酚－氯仿法提取受檢者外周血DNA，檢測(cè)純度和濃度后－20℃保存。

1.2.2 Real－time PCR SNP分型 采用Taqman－MGB探針對(duì)TRAF1/C5基因rs3761847和rs10818488位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，所用Real－time PCR探針購(gòu)自ABI公司。在羅氏LightCycler?480Real－time PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 檢測(cè)RA組類風(fēng)濕因子（RF）、抗CCP抗體（抗－CCP）和抗Sa抗體（抗－Sa）三項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)，采用RF膠乳凝集法測(cè)定試劑盒（購(gòu)自上海捷門生物技術(shù)合作公司）檢測(cè)RF水平，抗環(huán)瓜氨酸肽（CCP）抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自上海科新生物技術(shù)股份有限公司）檢測(cè)抗－CCP水平，抗Sa抗體IgG酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自歐蒙醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)有限公司）檢測(cè)抗－Sa水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。計(jì)算兩組各個(gè)基因型及等位基因頻率，并進(jìn)行Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，各組基因型及等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)計(jì)算比值比（OR）和95%置信區(qū)間（95%CI）。用SHEsis在線分析軟件對(duì)TRAF1/C5基因rs3761847和rs10818488兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析。

2 結(jié) 果

2.1 TRAF1/C5基因與RA相關(guān)性分析 在貴州漢族RA患者中，TRAF1/C5基因的兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點(diǎn)均符合Hardy－Weinberg平衡。與對(duì)照組比較，RA組兩個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 連鎖不平衡和單倍體基因型分析 對(duì)rs3761847和rs10818488兩個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型信息在對(duì)照組中進(jìn)行連鎖不平衡分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)位點(diǎn)存在高度連鎖不平衡（D′＝1.000，r2＝0.852），見附圖1（見《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”）。理論上這兩個(gè)位點(diǎn)共可組成4種單倍體基因型，筆者對(duì)其中頻率大于0.03的3種單倍體基因型進(jìn)行了進(jìn)一步的分析比較：在對(duì)照組和RA組中3種單倍體基因型的分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

2.3 TRAF1/C5基因與RF、抗－CCP、抗－Sa水平的相關(guān)性分析 與對(duì)照組相比，rs3761847位點(diǎn)A等位基因與RF陰性（P＝0.001，OR＝0.57，95%CI：0.41～0.79），抗－CCP陰性（P＝0.001，OR＝0.51，95%CI：0.35～0.76）及抗－Sa陰性相關(guān)（P＝0.02，OR＝0.72，95%CI：0.55～0.94），rs10818488位點(diǎn)G等位基因僅與RF陽(yáng)性組相關(guān)（P＝0.01，OR＝1.40，95% CI：1.09～1.81），見表3、4。

3 討 論

TRAF1介導(dǎo)TNF受體1、2和CD40參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而TNF是RA發(fā)病機(jī)制中的重要細(xì)胞因子［3］。TRAF1還與T細(xì)胞的活化增殖有關(guān)［4］，TRAF1基因敲除的小鼠T細(xì)胞過(guò)度增殖或受到T細(xì)胞受體復(fù)合物刺激時(shí)過(guò)度增殖以應(yīng)答TNF。TRAF1在這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起到負(fù)調(diào)節(jié)作用以維持炎癥反應(yīng)的環(huán)境［5］，從而在RA中發(fā)揮作用。雖然TRAF1在多種受體介導(dǎo)的信號(hào)通路中起作用，但TRAF1的分子機(jī)制還沒(méi)有完全闡明，其在RA中作用有待于進(jìn)一步研究。補(bǔ)體途徑也參與了RA的發(fā)病，C5裂解成促炎癥反應(yīng)的C5a和C5b，進(jìn)而啟動(dòng)攻膜復(fù)合物的形成。RA患者關(guān)節(jié)滑液持續(xù)的炎癥反應(yīng)與高水平的C5a同時(shí)存在［6］。小鼠模型研究證實(shí)了C5基因是RA的候補(bǔ)基因，同時(shí)證明了C5缺陷的小鼠可抵抗炎性關(guān)節(jié)炎，表明了C5基因在炎癥反應(yīng)中的作用［7－8］。因此，C5在RA發(fā)病機(jī)制中可能通過(guò)上調(diào)RA患者關(guān)節(jié)腔內(nèi)補(bǔ)體活化程度來(lái)起作用。

本研究發(fā)現(xiàn)TRAF1/C5的兩個(gè)SNPs存在基因多態(tài)性，但RA組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能與貴州漢族人群RA易感性無(wú)關(guān)，這一結(jié)果與其他人種研究結(jié)果不盡相同［1，9－10］。這一情況說(shuō)明了RA的遺傳異質(zhì)性，不同人種之間遺傳學(xué)研究結(jié)果常不相同。經(jīng)連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)TRAF1/C5兩個(gè)SNPs位點(diǎn)在對(duì)照組人群中呈現(xiàn)高度連鎖不平衡（D′＝1.000，r2＝0.852），與HapMap發(fā)布的數(shù)據(jù)基本一致（r2＝1），但構(gòu)建的單倍體基因型則與RA發(fā)病不相關(guān)（P＞0.05）。由于國(guó)內(nèi)外大量的病例－對(duì)照研究均局限于驗(yàn)證基因與RA患者的關(guān)聯(lián)性，較少涉及這些多態(tài)性位點(diǎn)的單倍體基因型，因此單倍體基因型與RA的關(guān)系有待于不同種族、大樣本量的研究證實(shí)。另外本研究還發(fā)現(xiàn)TRAF1/C5基因rs3761847位點(diǎn)A等位基因與RF陰性、抗－CCP陰性及抗－Sa陰性相關(guān)，這表明該位點(diǎn)可能增加自身抗體陰性RA者的易感性；rs10818488位點(diǎn)G等位基因僅與RF陽(yáng)性相關(guān)，表明該位點(diǎn)可能在RF陽(yáng)性者RA的發(fā)病中起重要作用，但是受到標(biāo)本量的影響，這些結(jié)果還有待于進(jìn)一步加大樣本量進(jìn)行分析，目前的研究結(jié)果也存在爭(zhēng)議［1，9］。

本研究首次以貴州漢族人群為研究對(duì)象，結(jié)果顯示TRAF1/C5SNPs基因型或多態(tài)性位點(diǎn)可能與貴州漢族人群RA的發(fā)病無(wú)關(guān)，可能是由于受到樣本量較小，TRAF1/C5 SNPs單倍體基因型及等位基因與RA患者血清學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系沒(méi)有得到很好的證實(shí)。

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Association of the TRAF1/C5 gene polymorphism with rheumatoid arthritis in Han population of Guizhou Province＊

Liang Aifeng1，F(xiàn)ei Ying2△
（1.Department of Clinical Laboratory，Qingpu Branch of Zhongshan Hospital Affiliated to Fudan University，Shanghai 201700，China；2.Department of Clinical microbiology and Immunology，the Affiliated Hospital of Guiyang Medical College，Guiyang，Guizhou550004，China）

ObjectiveTo explore the association between the tumor necrosis factor receptor－associated factor 1（TRAF1）/complement component 5（C5）single nucleotide polymorphism and rheumatoid arthritis patients.MethodsTwo groups of people were included in the study：300rheumatoid arthritis（RA）patients（RA group）and 300healthy individuals（control group）.Real－time PCR was used to test the single nucleotide polymorphisms rs3761847and rs10818488of TRAF1/C5.ResultsThere was no significant difference（P＞0.05）of TRAF1/C5rs3761847and rs10818488polymorphism between the two groups.The linkage disequilibrium analysis results showed that there was strong linkage disequilibrium between rs3761847and rs10818488.For the RF，anti－CCP and anti－Sa negative RA patients，the difference in the frequency of A allele of rs3761847between the RA patients and matched controls was statistically significant（P＝0.001，OR＝0.57，95%CI：0.41－0.79；P＝0.001，OR＝0.51，95%CI：0.35－0.76；P＝0.02，OR＝0.72，95%CI：0.55－0.94）.Significant difference for the frequency of G allele of rs10818488between RF positive RA patients and control groups was observed（P＝0.01，OR＝1.40，95%CI：1.09－1.81）.ConclusionTRAF1/C5gene polymorphism may not associate with susceptibility of RA patients in Han population in Guizhou.

tumor necrosis factor receptor－associated factor； complement component； single nucleotide polymorphisms；rheumatoid arthritis

10.3969/j.issn.1673－4130.2015.03.010

A

1673－4130（2015）03－0310－03

2014－11－10）

貴陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目［（2010）筑科農(nóng)合同第1－社－17號(hào)］。 作者簡(jiǎn)介：梁愛(ài)鳳，女，檢驗(yàn)技師，主要從事分子生物學(xué)檢測(cè)方面的研究。△

，Email：645903661＠qq.com。