人克羅恩氏病與奶中副結(jié)核菌—人類關(guān)注的熱點

鞏紅霞　鞏強

摘要：副結(jié)核分枝桿菌能引起反芻動物的慢性腸炎，并有學(xué)者提出它也是引發(fā)人克羅恩氏病的病原體，但其傳播途徑目前仍然不是十分明確，然而有些證據(jù)卻表明人感染此菌是因為食入了污染副結(jié)核分枝桿菌的牛奶而遭受感染的，就目前而言，巴氏滅菌是否可以有效的殺滅污染奶樣中的菌體，仍是未知數(shù)。我們以前已經(jīng)做過在牛奶中添加副結(jié)核菌，通過高溫短時的巴氏滅菌（72℃，15s）處理后，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)檢測不到菌的存在。但是副結(jié)核菌是細胞內(nèi)的病原體，在巨噬細胞中存活，并且呈叢狀生長。估計在奶中可以躲避殺滅而殘存下來。最近一篇關(guān)于愛爾蘭的零售奶樣本的報道指出副結(jié)核菌已成功的從奶樣本中培養(yǎng)成活。

關(guān)鍵詞：副結(jié)核菌；Johne's??；牛奶；巴氏滅菌

1895年Johne和Frothingham首次報道了牛副結(jié)核菌，他們從嚴重感染腸炎的牛腸道中，成功分離出抗酸染色的細菌，接著證明它是引發(fā)反芻動物肉芽腫腸炎的病原體，副結(jié)核菌臨床表現(xiàn)為極其復(fù)雜的無法治愈的腹瀉、漸進性消瘦并最終死亡。發(fā)病時，腸道變皺增厚，不能正常的吸收營養(yǎng)。牛感染途徑是通過母體子宮及接觸和吸食了副結(jié)核菌污染的糞便和奶，但直到3～5歲時才有臨床癥狀，應(yīng)激反應(yīng)如分娩、哺乳或寄生蟲可以加速臨床癥狀的出現(xiàn)。副結(jié)核病引起的經(jīng)濟損失也是巨大的，如在美國有20～40%的奶牛受到感染，有亞臨床癥狀的牛會增加乳腺炎的發(fā)生導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降。并且本病無特效藥進行治療，唯一減少損失的方法是通過臨床進行淘汰和凈化。

1副結(jié)核菌引發(fā)的爭議

1.1副結(jié)核菌對人類的影響 副結(jié)核菌是否是人類的病原菌仍處于爭議階段，但有大量的資料表明，人的克羅恩氏患者中確實分離到副結(jié)核菌的存在。而目前感染此菌的奶和肉制品是否存在潛在的危害也不太清楚，本篇討論的主題是：存在于奶中的副結(jié)核菌對消費者有危害嗎？巴氏滅菌后副結(jié)核菌能殘存下來嗎？副結(jié)核菌是人克羅恩氏病的病原嗎？首先證實第一個問題：存在于臨床癥狀和亞臨床癥狀的牛糞便和奶中的副結(jié)核菌濃度很低（5～8CFU/50mL的奶），此外有副結(jié)核菌的奶也僅發(fā)生于個體動物，在加工廠，從許多農(nóng)場收集到的奶要混在一起，這就進一步稀釋了副結(jié)核菌的濃度。在1996年，美國一家實驗室承擔了國家動物健康監(jiān)測任務(wù)：牛奶監(jiān)測，即關(guān)于美國副結(jié)核病在牛場傳播的綜合性研究，在血清學(xué)分析的基礎(chǔ)上，69個牛場通過血清學(xué)分析檢測到副結(jié)核菌陽性，他們每隔2w收集一次罐裝奶樣本，持續(xù)6w。船運冷凍送達實驗室培養(yǎng)和PCR分析，在培養(yǎng)12w后，發(fā)現(xiàn)沒有副結(jié)核活菌存在，并且PCR檢測也為陰性。得出的結(jié)論是：奶中的副結(jié)核菌已被稀釋到兩種方法均檢測不到的濃度。但是奶牛場中，糞便中有大量副結(jié)核菌污染奶而使菌殘留下來，仍是一個值得關(guān)注的熱點問題。從克羅恩氏患者的腸組織中檢測到的分枝桿菌有：偶發(fā)分枝桿菌病、多胞內(nèi)分枝桿菌、龜分枝桿菌病和堪薩斯分枝桿菌病，同時也分離培養(yǎng)出副結(jié)核分枝桿菌，并通過PCR和DNA序列鑒別出來。

1.2克羅恩氏病的確診 因為克羅恩氏病的臨床癥狀與副結(jié)核病的晚期癥狀類似，所以有研究者提出副結(jié)核菌可能是引發(fā)本病的罪魁禍首，有兩篇文章描寫了從克羅恩氏患者的腸組織中發(fā)現(xiàn)了特異的副結(jié)核菌的DNA序列，但大部分的研究卻表明在克羅恩氏患者中并未檢測到副結(jié)核菌。克羅恩氏病和副結(jié)核菌的潛在的聯(lián)系，對奶牛場來說已經(jīng)成為一個不可回避的問題。自從1994年美國報道了在零售巴氏滅菌奶中培養(yǎng)出副結(jié)核菌的研究后，表明巴氏滅菌奶后殘存的副結(jié)核菌會緩慢的生長，但是副結(jié)核菌在65℃30min和72℃15s加熱處理后，副結(jié)核菌能否殘存下來的研究結(jié)論是高度有爭議。因為副結(jié)核菌是一個潛在的動物傳染病的病原體及它與克羅恩氏病的聯(lián)系特性，原奶中副結(jié)核菌滅活所需的最佳時間和溫度條件的研究是目前的熱點項目。

2實驗研究

2.1巴氏滅菌奶的評估 接下來的工作是去評估兩種巴氏滅菌奶即標準方法（63.5℃30min）和高溫短時（HTST）殺滅副結(jié)核菌的效果，在這個研究中接種了104或107CFU/mL的副結(jié)核菌，然后進行上述的處理，對兩種方法來說，副結(jié)核菌的數(shù)量都明顯的減少，然而，在每一系列的試驗中，奶中仍有殘留的副結(jié)核菌存活下來。其中一個原因可能是實驗時熱穿透力不夠，因為HTST巴氏滅菌奶是模擬商業(yè)滅菌的加熱和冷卻的條件，熱交換是通過循環(huán)水加熱到特定溫度并且熱處理過程中奶處于靜止狀態(tài)，但商業(yè)性的巴氏滅菌奶有系列的管路和盤子，奶在熱處理時會有很大的流速，熱穿透非常均勻一致。在將奶經(jīng)過HTST巴氏滅菌后發(fā)現(xiàn)奶中仍含有10～103CFU/mL菌體，無論是用固體還是液體培養(yǎng)基都能在最初添加的102～103CFU/mL經(jīng)72℃15s加熱后檢出活菌，但是在10CFU/mL 或CFU/50mL的奶中卻沒有分離到活菌，研究結(jié)論是如果奶中的菌數(shù)量高于102CFU/mL就有可能存活下來，但低于10CFU/mL通過HTST就可滅活。

另一個實驗進一步比較了原有的方法（65℃30min）和HTST（72℃15s），在奶中添加高濃度（104、106、108CFU/mL）副結(jié)核菌，并將變化的溫度和時間相結(jié)合，結(jié)果是，在水浴震蕩中浸入一個聚乙烯的小導(dǎo)管，放在65、72、74、76℃下30min，0～30min后仍有活菌存活，這個結(jié)果與Grant et al 用帶有瓶塞的玻璃管模擬原有的方法結(jié)果是一致的。相對來說72℃15s的處理能夠有效的殺死副結(jié)核菌，因為試驗設(shè)計巴氏滅菌是模擬氣流通過的商業(yè)巴氏滅菌奶技術(shù)。奶流通過一系列的不銹鋼快速加熱或冷卻產(chǎn)品，管道是彎曲的。兩個不同方法的結(jié)論是：氣流加熱奶對充分殺滅污染奶中副結(jié)核菌至關(guān)重要。

2.2副結(jié)核菌復(fù)活狀態(tài) 副結(jié)核菌自然屬性是呈叢狀生長，一般很少以單個菌落的方式存在，所以在巴氏滅菌中對叢狀細菌的殺滅是不夠的，并且副結(jié)核菌是一個細胞內(nèi)的病原體，在宿主的巨噬細胞中生存，所以在巴氏滅菌的處理過程中可能會因其在細胞內(nèi)生長而受到保護，有人從未感染副結(jié)核菌的牛中提取牛乳腺炎巨噬細胞后，加入副結(jié)核菌，然后加到原奶中，進行實驗室巴氏滅菌72℃15s后不能培養(yǎng)出副結(jié)核菌。這就與以前的實驗報告相互矛盾。在這項研究中所模擬的巴氏滅菌的實驗室方法也提供了原奶中副結(jié)核菌滅活的可靠性評估結(jié)果。研究結(jié)果表明：原有的方法是能夠充分殺滅副結(jié)核菌的，因為模擬HTST巴氏滅菌與現(xiàn)有的使用標準是不一致的。標準的HTST方法是加工車間必須有成套的不銹鋼盤，并有二次生產(chǎn)區(qū)、加熱區(qū)和冷卻區(qū)，此外與器具連接成一體的彎曲管的尺寸是一定的，在加熱時，奶通過管道能產(chǎn)生強大的氣流。

加熱后奶中殘留的副結(jié)核菌能否復(fù)活也是人們所關(guān)注的另一個焦點問題，許多的實驗室用HEYM培養(yǎng)基進行活菌計數(shù)，有兩個實驗室報道應(yīng)用BACTEC液體培養(yǎng)基是比固體培養(yǎng)基更為敏感，我們也嘗試應(yīng)用液體培養(yǎng)的方法去培養(yǎng)奶中的副結(jié)核菌，但均以失敗告終，因為奶中的其他雜菌生長速度過快，從而干擾了副結(jié)核菌的生長。有實驗室也研究了一些凈化步驟，如在培養(yǎng)集中加入抗生素來抑制其他雜菌的生長的方法。目前已經(jīng)有更好的從奶中分離副結(jié)核菌的新方法，這個方法就是免疫磁珠法：即在磁珠上包被副結(jié)核菌的多克隆抗體來富集副結(jié)核菌，通過DNA提取及PCR的檢測，免疫磁珠最大能結(jié)合105CFU/mL，最小可結(jié)合10CFU/mL副結(jié)核菌，這個方法比目前的培養(yǎng)法要敏感10倍。

3討論

奶中副結(jié)核菌已成為公眾關(guān)注的熱點問題，考慮到有真菌和非抗酸性細菌的影響，美國一家實驗室應(yīng)用免疫磁珠-PCR法已成功的從30份原奶和31份巴氏滅菌奶中檢測到10株和6株副結(jié)核菌。然而由于收集的樣本量多達1000多份，至少要花費18個月的時間來完成下一步的任務(wù)，所以進一步的培養(yǎng)活菌仍然沒有結(jié)果。

美國農(nóng)業(yè)部始終將這一問題列入重點的監(jiān)測項目，為保障人民生命安全，我們國家也應(yīng)在這方面加大監(jiān)測力度，同時研究人員也應(yīng)進一步提高奶中副結(jié)核菌敏感性的檢測，同時還應(yīng)與當?shù)氐霓r(nóng)場一道研究和評估從患病牛、加熱奶以及初乳中副結(jié)核菌污染原奶的程度，得出的數(shù)據(jù)將有助于副結(jié)核病的預(yù)防、控制和傳播，從而減少不必要的經(jīng)濟損失和降低人畜共患病的發(fā)生。

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編輯/申磊