精子DNA結(jié)構(gòu)完整性與年齡、精子濃度、活力及形態(tài)的相關(guān)性研究

董波　宋焱鑫　谷玉　郭杰

摘要：目的 探討精子DNA結(jié)構(gòu)完整率與不育患者年齡、精子濃度、活力及形態(tài)的相關(guān)性。方法 回顧性分析2013年1月～2014年5月到我中心生殖醫(yī)學(xué)研究所行精子DNA結(jié)構(gòu)完整性檢查的不育癥患者874例，以染色質(zhì)擴(kuò)散法，進(jìn)行檢測(cè)，其中異常者80例。結(jié)果 DNA結(jié)構(gòu)完整率正常組與異常組在年齡、精子濃度、活力及形態(tài)學(xué)有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論 年齡、精子濃度、活力均跟精子DNA結(jié)構(gòu)完整性有相關(guān)性，精子形態(tài)學(xué)與精子DNA結(jié)構(gòu)完整性無(wú)明顯相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：年齡；精子濃度；精子活力；精子形態(tài)；精子DNA結(jié)構(gòu)完整性

在不育夫婦中，男性不育因素約占50%[1]，精子DNA損傷可能影響輔助生殖技術(shù)（ART）的結(jié)局，增加復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的發(fā)生率及卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）后代的遺傳風(fēng)險(xiǎn)等相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此精子DNA完整性檢測(cè)不僅有助于探索不育的病因，而且有望成為ART治療結(jié)局的重要評(píng)估手段[3]。睪丸局部溫度增高、嚴(yán)重身心疾病、高熱、環(huán)境毒物、吸煙、嗜酒、藥物和年齡增高等原因都可能造成精子DNA的損傷，相關(guān)研究證實(shí)，空氣污染和吸煙均會(huì)導(dǎo)致精子DNA的碎片化程度增高[4]。本研究通過(guò)分析患者的精子濃度、活力及形態(tài)的常規(guī)檢查和精子DNA結(jié)構(gòu)完整性檢測(cè)結(jié)果，并結(jié)合患者年齡，以探討不育患者年齡、精子濃度、活力及形態(tài)學(xué)與精子DNA完整性的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年1月～2014年5月在洛陽(yáng)市婦女兒童醫(yī)療保健中心生殖醫(yī)學(xué)研究所就診的行精子DNA完整性檢測(cè)的874例男性不育患者作為本次研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)為：年齡在20～50歲（含20及50歲）的身體健康、無(wú)家族遺傳性疾病、無(wú)睪丸外傷及性功能障礙病史、無(wú)不良生活習(xí)慣（嗜酒、吸毒等），睪丸、附睪及輸精管體檢無(wú)明顯異常[5]的男性患者。

1.2方法

1.2.1精液標(biāo)本收集 禁欲2～7d，手淫法取精液于一次性精液采集器內(nèi)，置37℃溫箱液化，常規(guī)記錄精液的體積、pH值。

1.2.2 精液常規(guī)檢查 采用康泰CMS100醫(yī)學(xué)影像學(xué)工作站【康泰精子質(zhì)量析系統(tǒng)】分析精子的濃度、活力。精液標(biāo)本洗滌后，涂片，以（臺(tái)資）珠海貝索生物技術(shù)有限公司的Diff-Quik試劑快速染色，應(yīng)用康泰CMS100醫(yī)學(xué)影像學(xué)工作站【康泰精子質(zhì)量析系統(tǒng)】分析精子形態(tài)。

1.2.3精子DNA碎片檢測(cè) 本研究方法采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散法，試劑選用深圳市博銳德生物科技有限公司生產(chǎn)的精子DNA碎片檢測(cè)試劑盒。精液標(biāo)本主要處理過(guò)程：常規(guī)檢查后以生理鹽水調(diào)整液化的新鮮精子濃度至5～10×106/ml。取出精子濃度為5～10×106/ml的待測(cè)標(biāo)本60μl加入已熔化的易熔凝膠管，充分混勻，37℃孵育待用。將包被載玻片置于2～8℃冰箱預(yù)冷5min取出，迅速加入30μl精子凝膠混合液于載玻片上，迅速蓋上蓋玻片，置于2～8℃冰箱，使其凝固。5min后從冰箱中取出載玻片，小心移去覆蓋在上面的蓋玻片。將載玻片立即垂直浸入盛有反應(yīng)液A的反應(yīng)池，20～28℃準(zhǔn)確反應(yīng)7min，取出載玻片，濾紙吸去背面及側(cè)面殘存液體，再將載玻片垂直浸入盛有反應(yīng)液B的反應(yīng)池內(nèi)，20～28℃準(zhǔn)確反應(yīng)25min，取出載玻片，濾紙吸去背面及側(cè)面殘存液體，再將載玻片水平浸入蒸餾水中5min，其間換水1～2次。將載玻片依次放入分別盛有70%、90%和100%乙醇的反應(yīng)池中各2min。空氣中自然干燥后，載玻片以瑞氏染液15～20滴覆蓋，稍等片刻再緩慢地加入瑞氏緩沖液30～40滴，以洗耳球輕輕吹打混合染液，室溫15min后以流水輕輕沖洗染片。自然干燥或吹干后，在高倍顯微鏡下觀察500個(gè)精子，計(jì)數(shù)存在DNA碎片的精子數(shù)量。精子DNA碎片判定標(biāo)準(zhǔn)為：精子頭部?jī)H產(chǎn)生較小的光暈或無(wú)光暈，單側(cè)光暈的厚度不超過(guò)精子頭部最小直徑的1/3。精子DNA碎片率（%）=存在DNA碎片精子數(shù)÷被觀察精子總數(shù)×100%。正常參考值：精子DNA碎片率<25%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0軟件完成，計(jì)量資料以x±s表示。各組組間的分析采用單因素方差分析。不育男性精子DNA完整程度與年齡、精子濃度、活力和形態(tài)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中濃度、活力及精子形態(tài)學(xué)各參數(shù)按照WHO第五版規(guī)定[6]。

2結(jié)果

2.1年齡與精子DNA完整程度的關(guān)系 年齡以35歲為界限分組，<35歲者共計(jì)551人，DNA碎片率檢測(cè)x±s為13.3±6.73；≥35歲者共計(jì)323人，DNA碎片率檢測(cè)x±s為14.9±6.83。結(jié)果顯示年齡越小，DNA碎片率越低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值<0.05），見(jiàn)表1。

2.2精子濃度與精子DNA完整程度的關(guān)系 按照濃度<15×106/ml，15～100×106/ml，>100×106/ml，分成三組檢測(cè)其DNA碎片率x±s分別為13.8±7.30，13.5±6.77，15.3±6.77，結(jié)果顯示，當(dāng)精子濃度低于正常值15×106/ml時(shí)，與濃度正常時(shí)DNA碎片率無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；當(dāng)精子濃度>100×106/ml比濃度15～100×106/ml時(shí)DNA碎片率增高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值<0.05），見(jiàn)表2～表3。

2.3精子總活力與精子DNA完整程度的關(guān)系 按精子總活力正常及不正常分組，總活力<40%者，總活率≥40%者，其DNA碎片率檢測(cè)x±s為18.1±8.32，13.1±6.44。結(jié)果顯示，當(dāng)精子活力≥40% DNA時(shí)碎片率低，精子活力<40% 時(shí)DNA碎片率高，且具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值<0.05），見(jiàn)表5。

2.4精子形態(tài)學(xué)與精子DNA完整程度的關(guān)系 以正常形態(tài)率≥4%分界，<4%者與≥4%者DNA碎片率檢測(cè)x±s分別為15.2±6.35，13.7±6.88，結(jié)果顯示，精子形態(tài)學(xué)分析正常者比形態(tài)異常者DNA碎片率均值偏低，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值>0.05）。見(jiàn)下表：

3討論

精子異常是導(dǎo)致男性不育的主要原因之一。目前男性精液常規(guī)檢查主要包括精液的量、pH值、精子的濃度、活力和形態(tài)[7]。但臨床中大約有15%的男性不育癥患者，精液常規(guī)檢查是正常的[8]。因此，僅僅進(jìn)行精液常規(guī)檢查而進(jìn)行男性生育能力以及助孕治療結(jié)局的判定還是不夠的。在過(guò)去的10 年中，人們?cè)絹?lái)越重視精子DNA完整性在男性不育診療中的作用。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道較多，但國(guó)內(nèi)相對(duì)有限，且認(rèn)識(shí)不一，有學(xué)者認(rèn)為精子DNA完整性與精液常規(guī)各參數(shù)無(wú)相關(guān)性[9]；有的認(rèn)為精子DNA碎片化指數(shù)與精子的密度、總活動(dòng)率及精子正常形態(tài)率具有負(fù)相關(guān)性[10]；還有的認(rèn)為與男性年齡顯著性正相關(guān)，與直線運(yùn)動(dòng)精子百分率顯著性負(fù)相關(guān)[11]。為進(jìn)一步研究精子DNA完整性的臨床意義，我們從2013年1月起，對(duì)在我中心生殖醫(yī)學(xué)研究所接受輔助生育技術(shù)治療的患者進(jìn)行了精子DNA碎片與輔助生殖技術(shù)相關(guān)性的研究，該項(xiàng)目在洛陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)局立項(xiàng)（項(xiàng)目編號(hào)1302018B）。同時(shí)，對(duì)不育癥門(mén)診就診的男性患者精子DNA結(jié)構(gòu)完整性與年齡、精子濃度、活力及形態(tài)等參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者年齡大于35歲時(shí)，DNA碎片率高于小于35歲者，說(shuō)明精子DNA碎片率與年齡有關(guān)；精子濃度在100×106/ml以下時(shí)，精子DNA碎片率無(wú)明顯差異，當(dāng)濃度大于100×106/ml時(shí)，精子DNA碎片率明顯增高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，原因尚不明確；精子總活力小于40%時(shí)，精子DNA碎片率明顯增高，說(shuō)明精子DNA碎片率與活力有關(guān)；精子形態(tài)學(xué)方面，精子正常形態(tài)與精子DNA碎片率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，無(wú)明顯相關(guān)性。本研究可以得出，精子DNA碎片率與年齡、濃度及活力均有關(guān)，而與形態(tài)無(wú)關(guān)。

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編輯/申磊