甲狀腺及乳房多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織WIF-1基因mRNA表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)分析

于進(jìn)堂，刁力，李君平，徐世晨

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院海陽(yáng)分院內(nèi)分泌科，山東 海陽(yáng) 265100)

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甲狀腺及乳房多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織WIF-1基因mRNA表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)分析

于進(jìn)堂，刁力，李君平，徐世晨

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院海陽(yáng)分院內(nèi)分泌科，山東 海陽(yáng) 265100)

目的 探討甲狀腺、乳房多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織WIF-1基因mRNA表達(dá)及其啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。方法 采用RT-PCR及甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測(cè)33例甲狀腺、乳房多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織WIF-1基因mRNA表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，以30例單純甲狀腺乳頭狀癌和20例甲狀腺良性病變組織作為對(duì)照。結(jié)果 多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織、單純甲狀腺乳頭狀癌組織和甲狀腺良性病變組織WIF-1基因的表達(dá)缺失率分別為51.5%(17/33)、36.7%(11/30)、15.0%(3/20)，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.105，P<0.05)。多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織、單純甲狀腺乳頭狀癌組織WIF-1基因的甲基化率分別為45%(15/33)、43%(13/30)，高于甲狀腺良性病變組織的10%(2/20)，差異有顯著性(χ2=6.349、7.185，P<0.01),但多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織與單純甲狀腺乳頭狀癌組織相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)。結(jié)論 WIF-1基因mRNA表達(dá)缺失在甲狀腺、乳房多原發(fā)癌的發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用；WIF-1基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)可能是其mRNA低表達(dá)的機(jī)制之一。

腫瘤,多原發(fā)性；甲狀腺腫瘤；乳房腫瘤；WIF-1；DNA甲基化

多原發(fā)癌是指同一器官或不同器官同時(shí)或先后發(fā)生兩種或兩種以上的原發(fā)性惡性腫瘤。導(dǎo)致多原發(fā)癌的原因是多方面的，其中宿主易感性與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系，抑癌基因的突變可導(dǎo)致原癌基因變成致癌基因，引起癌細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。很多研究趨向于多原發(fā)癌源于相同的致癌基因，而抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化狀態(tài)是沉默抑癌基因的重要表觀遺傳學(xué)機(jī)制，可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，成為目前抑癌基因的研究熱點(diǎn)之一[1-2]。抑癌基因WIF-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化后，其表達(dá)降低，對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制作用減弱，可誘發(fā)腫瘤。已有多項(xiàng)調(diào)查揭示了甲狀腺惡性腫瘤與乳癌之間可能存在某種聯(lián)系[3-5]。但到目前為止，兩者間有無(wú)聯(lián)系、通過(guò)何種途徑發(fā)生聯(lián)系尚無(wú)明確的結(jié)論。本研究以單純甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺良性病變組織為對(duì)照，通過(guò)檢測(cè)甲狀腺、乳房多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織WIF-1基因mRNA表達(dá)及甲基化狀態(tài)，旨在闡明其與多原發(fā)癌發(fā)生的可能關(guān)系。

1 材料和方法

1.1標(biāo)本來(lái)源

收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院2007—2011年間33例甲狀腺、乳房多原發(fā)癌病人的甲狀腺癌組織(均為石蠟切塊)，30例單純甲狀腺乳頭狀癌病人甲狀腺癌組織(石蠟切塊10例，新鮮組織20例)，20例甲狀腺良性病變組織(均為新鮮組織)。新鮮組織切除后，液氮保存。

1.2方法

1.2.1DNA、RNA提取 應(yīng)用氨-氯仿抽提方法從組織中提取DNA，按試劑盒(博日公司)的操作方法從組織中提取RNA。

1.2.2RT-PCR 按TaKaRa DRR037A試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。引物由上海生工生物工程有限公司合成。WIF-1上游引物序列為5′-TCGTTAAAGCCT-GTCTGC-3′，下游引物序列為5′-CCTTTTATTGCAGTGTCTTCCA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度111 bp;β-actin上游引物序列為5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAA-CA-3′，下游引物序列為5′-CATCTCTTGCTCGAA-GTCCA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度318 bp。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳并分析產(chǎn)物，凝膠成像自動(dòng)分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3亞硫酸氨鹽修飾DNA 將2 μg DNA和5.5 μL新鮮配制的 NaOH(3 mol/L)加入50 μL反應(yīng)體系中，42 ℃水浴30 min，再加入10 mmol/L氫醌30 μL和3.6 mol/L亞硫酸氫鈉520 μL，50 ℃避光水浴16 h。利用DNA純化試劑盒(Promega公司)純化修飾過(guò)的DNA，加入5.5 μL NaOH，37 ℃水浴15 min，加入10 mol/L乙酸銨33 μL和冰無(wú)水乙醇270 μL沉淀過(guò)夜(-20 ℃)，離心，沉淀經(jīng)體積分?jǐn)?shù)0.70乙醇洗滌后，重溶于去離子水中待用。

1.2.4甲基化特異性PCR(MSP) 以亞硫酸氫鹽修飾的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。甲基化和未甲基化的WIF-1基因啟動(dòng)子引物由上海生工生物工程有限公司合成。MSP-M上游引物序列為5′-GGGCCTTT-TATTGGGCGTAT-3′，下游引物序列為5′-AAAC-CAACAATCAACGAAC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度198 bp；MSP-U上游引物序列為5′-GGGTGTTTTATTGGGT-GTAT-3′，下游引物序列為5′-TCCTAAATACAA-ACTCTCCTC-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為198 bp。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像自動(dòng)分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。結(jié)果判定：利用甲基化引物能擴(kuò)增出產(chǎn)物、未甲基化引物不能擴(kuò)增出產(chǎn)物為完全甲基化，相反情況為完全未甲基化，兩者都能擴(kuò)增出產(chǎn)物為部分甲基化。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Bonferroni法比較3組基因表達(dá)缺失有無(wú)差異，若有差異，采用分割法進(jìn)行兩兩比較。3組比較時(shí)α=0.05，兩兩比較時(shí)α′=0.0167。

2 結(jié) 果

2.1WIF-1基因mRNA表達(dá)

多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織、單純甲狀腺乳頭狀癌組織和甲狀腺良性病變組織WIF-1基因的表達(dá)缺失率分別為51.5%(17/33)、36.7%(11/30)和15.0%(3/20)，3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.105，P<0.05)。多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織中WIF-1基因mRNA的表達(dá)缺失率顯著高于甲狀腺良性病變組織(χ2=7.067，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

2.2WIF-1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織、單純甲狀腺乳頭狀癌組織和甲狀腺良性病變組織WIF-1基因的甲基化率分別為45%(15/33)、43%(13/30)、10%(2/20)，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.834，P<0.05)。組間兩兩比較，多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織、單純甲狀腺乳頭狀癌組織WIF-1基因的甲基化率明顯高于甲狀腺良性病變組織，差異有顯著性(χ2=6.349、7.185，P<0.01)；而多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織與單純甲狀腺乳頭狀癌組織相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

M:DNA Marker；①、③、⑤、⑦為甲狀腺、乳房多原發(fā)癌組織；②、④、⑥、⑧為單純甲狀腺乳頭狀癌組織；⑨為甲狀腺良性病變組織；H2O：空白對(duì)照。

圖1 WIF-1基因mRNA表達(dá)電泳結(jié)果

P：陽(yáng)性對(duì)照；T：甲狀腺、乳房多原發(fā)癌組織；N：?jiǎn)渭兗谞钕偃轭^狀癌組織；B：甲狀腺良性病變組織；H2O：空白對(duì)照；U：未甲基化DNA；M：甲基化DNA。

圖2 WIF-1基因mRNA甲基化檢測(cè)結(jié)果

2.3WIF-1基因表達(dá)與其甲基化發(fā)生的關(guān)系

在WIF-1 mRNA表達(dá)缺失的17例甲狀腺、乳房多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織中，12例發(fā)生了甲基化，而在16例WIF-1 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的組織中，僅3例發(fā)生了甲基化；11例WIF-1 mRNA表達(dá)缺失的單純甲狀腺乳頭狀癌組織中，共有9例發(fā)生了甲基化，而表達(dá)陽(yáng)性的19例中，僅3例發(fā)生了甲基化；在3例WIF-1 mRNA表達(dá)缺失的甲狀腺良性病變組織中有2例檢測(cè)出WIF-1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化，其余17例WIF-1 mRNA表達(dá)陽(yáng)性的組織未檢出甲基化。WIF-1 mRNA的表達(dá)與其甲基化的發(fā)生有密切聯(lián)系(χ2=4.043，P<0.05)。

3 討 論

Wnt信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞增殖與分化等活動(dòng)，其基因表達(dá)異?？烧T發(fā)腫瘤發(fā)生。WIF-1基因位于人染色體的12q14.3，其編碼的蛋白為保守型分泌性WIF-1蛋白，該蛋白能抑制Wnt的活性。啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化可使WIF-1基因所編碼的WIF-1蛋白下調(diào)或缺失，從而不能阻斷Wnt信號(hào)通路，致核內(nèi)靶基因活化，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在多種腫瘤細(xì)胞株和組織中均發(fā)現(xiàn)WIF-1基因下調(diào)并伴有啟動(dòng)子甲基化[6-8]。

本文的結(jié)果顯示，多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織、單純甲狀腺乳頭狀癌組織、甲狀腺良性病變組織中WIF-1基因的表達(dá)缺失率差異有顯著性。提示甲狀腺、乳房多原發(fā)癌的發(fā)生可能與WIF-1 mRNA的表達(dá)缺失密切相關(guān)。MSP檢測(cè)結(jié)果顯示，甲狀腺良性病變組織WIF-1基因的甲基化率明顯低于多原發(fā)癌和單純甲狀腺癌組織，盡管甲狀腺、乳房多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織WIF-1基因甲基化率較單純甲狀腺乳頭狀癌組織高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)WIF-1基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化可能是引起其mRNA低表達(dá)的機(jī)制之一。盡管甲狀腺、乳房多原發(fā)癌病人甲狀腺癌組織WIF-1基因甲基化率較單純甲狀腺乳頭狀癌組織高，但差異無(wú)顯著性，而兩者mRNA表達(dá)差異有顯著性。原因可能為：WIF-1基因mRNA表達(dá)受到多種因素的調(diào)控，高甲基化狀態(tài)只是其低表達(dá)的機(jī)制之一；標(biāo)本數(shù)量有限。

綜上所述，甲狀腺癌(包括甲狀腺、乳房多原發(fā)癌和單純甲狀腺乳頭狀癌)的發(fā)生可能與WIF-1基因mRNA的低表達(dá)有密切聯(lián)系，而WIF-1基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化可能是其低表達(dá)的機(jī)制之一。

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(本文編輯 馬偉平)

mRNA EXPRESSION AND PROMOTER METHYLATION OF WIF-1 GENE IN THYROID CANCER TISSUES OF PATIENTS WITH MULTIPLE PRIMARY CARCINOMAS OF BREAST AND THYROID

YUJintang,DIAOLi,LIJunping,XUShichen

(Department of Endocrinology, Haiyang Hospital, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Haiyang 265100, China)

ObjectiveTo investigate mRNA expression and the promoter methylation of WIF-1 gene in thyroid cancer tissue of patients with multiple primary carcinoma of thyroid (MPCT) and breast.MethodsThe mRNA expression and the promoter methylation of WIF-1 gene in 33 cases of thyroid cancer tissues in patients with multiple primary breast cancer (MPBC) and MPCT were analyzed by reverse transcription PCR (RT-PCR) and methylation specific PCR, and 30 cases of simple papillary thyroid carcinoma (SPTC) tissues and 20 cases of benign thyroid (BT) tissues served as controls.ResultsThe gene deletion rates of WIF-1 expressions in MPCT, SPTC and BT were 51.5% (17/33), 36.7% (11/30) and 15.0% (3/20), respectively, the diffe-rence between the three groups being significant (χ2=7.105,P<0.05). Methylation of WIF-1 gene in MPCT and SPTC was 45% (15/33) and 43% (13/30), respectively, which were higher than 10% (2/20) of BT, the difference being significant (χ2=6.349,7.185;P<0.01), but there was no significant difference between MPCT and SPTC (P>0.05).ConclusionThe absence of WIF-1 gene mRNA expression plays a key role in the process of the occurrence of multiple primary carcinomas in breast and thyroid. The promoter hypermethylation of WIF-1 gene is likely to be one of the mechanisms of low expression of its mRNA.

neoplasms, multiple primary; thyroid neoplasms; breast neoplasms; WIF-1; DNA methylation

2014-06-23;

2014-10-21

于進(jìn)堂(1965-)，男，副主任醫(yī)師。

R736.1

A

1008-0341(2015)02-0144-03