腸球菌抑菌活性及其安全性的研究進展

鄭 偉，李珍華，酈丹婷，張 忍，張 瑜，石陸娥

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310036)

腸球菌屬于乳酸菌，常見于人體腸道和日常發(fā)酵食品中.20 世紀初，國外就有學(xué)者開始研究腸球菌的抑菌活性，到目前為止，已有近10 000 篇相關(guān)文獻可在Google Scholar、ScienceDirect 和SpringerLink 等數(shù)據(jù)庫中檢索到.同時，具有廣譜抑菌作用的腸球菌已被應(yīng)用于食品發(fā)酵和疾病治療等領(lǐng)域，例如，在歐洲，尤其是南歐，含有腸球菌的發(fā)酵劑常常被用于傳統(tǒng)奶酪的生產(chǎn)［1］;在我國，具有腸球菌的混合菌劑則被用于治療動物腹瀉和腸道炎癥等疾病［2］.然而，有研究表明腸球菌在一定條件下，可以導(dǎo)致腹瀉、菌血癥、心內(nèi)膜炎和尿道感染等疾病，其應(yīng)用存在一定的安全隱患［3］. 為此，本文結(jié)合國內(nèi)外參考文獻，對腸球菌抑菌活性物質(zhì)及其安全性進行綜述，希望對腸球菌抑菌活性的研究及其安全使用起到一定的借鑒和指導(dǎo)作用.

1 抑菌活性物質(zhì)

國內(nèi)外學(xué)者對腸球菌的抑菌活性物質(zhì)進行過大量的研究，發(fā)現(xiàn)腸球菌具有抑菌效應(yīng)，主要是因為有機酸、過氧化氫、細菌素和類細菌素等物質(zhì)的產(chǎn)生.

1.1 有機酸(Organic acid)

一般認為，有機酸可以通過延長致病菌的代時以及破壞正常細胞的膜電位，來使致病菌的生長受到影響，此外，未解離的有機酸還可以透過細胞膜進入致病菌的細胞質(zhì)中，使胞內(nèi)的pH 值降低，同時胞內(nèi)游離的有機酸會進一步聚集，使得酸化程度加劇，最終導(dǎo)致細菌死亡［4］.Anyogu 等［5］從木薯發(fā)酵物中篩選出3株腸球菌，而這3 株菌的代謝產(chǎn)物均能夠抑制致病微生物生長，尤其是蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)，隨后相關(guān)試驗發(fā)現(xiàn)，這3 株腸球菌的代謝產(chǎn)物之所以具有抑菌效應(yīng)，是因為有機酸的產(chǎn)生和積累.

1.2 過氧化氫(Hydrogen peroxide)

在腸球菌的代謝過程中，氧分子會在黃素蛋白氧化酶或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NADH 氧化酶)的作用下形成過氧化氫［6］.形成的過氧化氫可以使細菌的一些關(guān)鍵酶發(fā)生氧化失活;也可以使細胞膜中的脂類發(fā)生過氧化反應(yīng)，進而改變膜的通透性，導(dǎo)致膜內(nèi)外紊亂;還有可以產(chǎn)生氧自由基，如超氧化物自由基()和氫氧化物自由基(OH·)，來破壞細菌的DNA，最終起到抑菌的作用［7］.

1.3 細菌素(Bacteriocin)

1.3.1 細菌素的定義與分類

隨著研究不斷地深入，人們對細菌素的認識也不斷地完善，目前認為細菌素是指某些細菌代謝過程中，由核糖體合成并分泌到環(huán)境中的一類對同源或者親緣關(guān)系較近的微生物具有抑制作用的蛋白質(zhì)或多肽［8］.根據(jù)細菌素的特點不同，可將細菌素分為以下4 類:Ⅰ類，羊毛硫類抗生素;Ⅱ類，熱穩(wěn)定性小分子肽;Ⅲ類，熱不穩(wěn)定性大分子肽;Ⅳ類，蛋白質(zhì)復(fù)合物.到目前為止，發(fā)現(xiàn)的大部分細菌素屬于Ⅱ類，這類細菌素具有熱穩(wěn)定、耐酸堿、分子量小(大約是30 ～60 個氨基酸殘基)和通常不經(jīng)過修飾等特點［9］.

1.3.2 細菌素的合成與分泌調(diào)節(jié)

研究［10］表明，細菌素的合成與分泌都是從細菌的對數(shù)生長中期開始并一直延續(xù)到穩(wěn)定期，并且該過程受到嚴格調(diào)控.通常情況下，細菌素的生產(chǎn)菌會分泌一種胞外信息素來對細菌素的形成進行調(diào)控，在細菌對數(shù)生長中期之前，這種信息素的含量很低，不足以啟動細菌素的合成與分泌，但隨著細菌數(shù)量的增加，胞外信息素的濃度也相應(yīng)提高，直至達到某一閾值，細菌素才開始合成并分泌出來.

1.3.3 細菌素的抑菌譜與抑菌機理

通常認為細菌素的抑菌譜較窄，只作用于同源或者親緣關(guān)系較近的微生物，然而有些細菌素除了作用于同源或親緣關(guān)系較近的菌株外，還能對食物腐敗微生物產(chǎn)生抑制作用［11］.例如細菌素S37，它不僅可以抑制親緣關(guān)系較近的腸球菌，而且可以抑制李斯特氏菌(Listeria spp.)等腐敗微生物的生長［12］.

關(guān)于細菌素的抑菌機理，一般認為，細菌素會非特異性或特異性地結(jié)合到細菌細胞膜表面上，而后引起一系列的抑菌作用，如:形成細胞質(zhì)膜離子透性通道，影響膜內(nèi)外質(zhì)子電動勢以及ATP 的合成;破壞蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)的合成，造成細菌新陳代謝的紊亂;引起細胞膜的穿孔，導(dǎo)致細菌因胞內(nèi)物質(zhì)的大量泄漏而死亡［13］.

1.3.4 細菌素的應(yīng)用

目前，細菌素在食品中的應(yīng)用方式主要有以下4 種:1)作為新型食品防腐劑應(yīng)用于食品的防腐與保鮮;2)生產(chǎn)微生態(tài)制劑用于人體保健;3)直接添加細菌素到食品中或以細菌素產(chǎn)生菌作為發(fā)酵劑生產(chǎn)發(fā)酵食品;4)細菌素柵欄技術(shù)的應(yīng)用.其中，研究最多和開發(fā)最成功的是食品防腐保鮮領(lǐng)域，現(xiàn)在正在開發(fā)和制備包含細菌素的食品包裝袋和保鮮膜［14］.

細菌素在動物疾病治療中也有一定的應(yīng)用，例如在養(yǎng)殖業(yè)，人們已經(jīng)開始逐步使用細菌素來替代原始抗生素去預(yù)防和治療動物腹瀉等腸道疾?。?5］.盡管這類應(yīng)用才剛剛起步，但迫于新型抑菌物質(zhì)的開發(fā)緩慢以及抗生素耐藥問題的日益嚴峻等情況，人們正在加快細菌素應(yīng)用深化的腳步.

1.4 類細菌素(Bacteriocin like inhibitory substances，BLIS)

類細菌素比細菌素具有更為廣闊的應(yīng)用前景，這是因為大部分細菌素僅僅抑制與其親緣關(guān)系較近的乳酸菌株和非乳酸菌的革蘭氏陽性細菌，對革蘭氏陰性菌和真菌則無效，而類細菌素不僅可以抑制親緣關(guān)系較近的乳酸菌和革蘭氏陽性菌，而且對革蘭氏陰性菌和真菌也有一定的抑制作用［16］.例如侯運華等［17］從一株腸球菌SE-81 中分離得到一種類細菌素物質(zhì)LK-S1，抑菌試驗結(jié)果表明，該物質(zhì)對溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草桿菌(Bacillus subtilis)等革蘭氏陽性菌和大腸桿菌(Escherichia coli)及鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)等革蘭氏陰性菌都有強烈的抑制作用.

2 安全性

盡管腸球菌具有抑菌作用并被應(yīng)用到食品和疾病治療等領(lǐng)域，但有研究表明腸球菌能夠產(chǎn)生毒性，并引起人體的不適和致病，常見的有腹瀉、菌血癥、心內(nèi)膜炎和尿道感染等［3］.因此，評估腸球菌的安全性顯得十分重要，這將決定了其能否順利地投入生產(chǎn)和使用.下面從耐藥性和毒力因子兩方面，簡單地介紹一下腸球菌所存在的安全隱患.

2.1 耐藥性(Antibiotic resistance)

耐藥性之所以受到全世界人們的關(guān)注，是因為具有廣譜耐藥性的菌株將會導(dǎo)致治療難度的增大、醫(yī)治途徑的減少和診治效果的不佳.早在20 世紀40年代，人們就發(fā)現(xiàn)青霉素不能夠很好地治療腸球菌所引起的心內(nèi)膜炎，此外，萬古霉素，一種糖肽類大分子抗生素，原本可以有效地對付多重耐藥性的腸球菌，但由于人們對萬古霉素的濫用，導(dǎo)致抗萬古霉素的腸球菌出現(xiàn)，從而增加了治療腸球菌相關(guān)疾病的難度［18］.目前，除了發(fā)現(xiàn)抗青霉素和萬古霉素的腸球菌外，還發(fā)現(xiàn)了抗氨芐青霉素、氯霉素、四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素和慶大霉素的腸球菌，幸運地是，具有廣譜耐藥性的腸球菌還尚未發(fā)現(xiàn)［19］.關(guān)于腸球菌的耐藥機理，人們也已經(jīng)做過深入的研究，如表1 所示.

表1 腸球菌耐藥機理Tab. 1 The antibiotic-resistant mechanisms of enterococci

另外需要注意的是，腸球菌能夠通過耐藥基因的轉(zhuǎn)移，來獲得新型抗生素的抵抗能力，所以，未來的研究方向不能只限于新型抗生素的發(fā)現(xiàn).Arias 等［18］認為可以從腸球菌附著和定植胃腸道的機制出發(fā)，找到新的方法來抑制或減少腸球菌在胃腸道中的定植，也可以與免疫技術(shù)相結(jié)合，研發(fā)出一種綜合性的治療方法.

2.2 毒力因子(Virulence factor)

腸球菌之所以具有安全隱患，還有一個重要原因，即含有毒力因子(表2).這些毒力因子不僅可以幫助腸球菌附著并破壞宿主細胞，而且可以對宿主體內(nèi)的特異性免疫和非特異性免疫產(chǎn)生抵抗作用.

表2 腸球菌的毒力因子Tab. 2 Enterococcal virulence factors

2.2.1 聚合物和腸球菌表面蛋白(Aggregation substance and enteococcal surface protein)

聚合物，是由性信息素質(zhì)粒所編碼形成的，具有粘附作用的細菌表面蛋白，它呈毛發(fā)狀，并不均勻分布在細菌表面，在它的一級結(jié)構(gòu)中，存在兩個RGD 序列，該序列可以與真核細胞表面受體整合素相結(jié)合，從而介導(dǎo)細菌與真核細胞之間的粘附，同時，也可以通過纖連蛋白結(jié)合到胞外基質(zhì)中［24］.Chow 等［25］通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，與未感染心內(nèi)膜炎的小兔相比，被感染的小兔體內(nèi)聚合物含量明顯上升，但只有同時提高聚合物和細胞溶素(另一種毒力因子)的表達量，小兔的死亡率才會上升.這表明在感染致病的過程中，聚合物起到的主要是粘附作用，而致病作用是由細胞溶素引起的，并且缺少其中的任何一個都不能引起小兔的死亡.

腸球菌表面蛋白，是由esp 基因編碼形成的高分子量表面蛋白，共含有1 873 個氨基酸殘基，按照結(jié)構(gòu)和功能的不同，可劃分為4 個區(qū)域，分別為N 端結(jié)構(gòu)域、核心區(qū)、C 端跨膜區(qū)和錨定域［26］.Heikens 等［27］認為在感染致病過程中腸球菌表面蛋白量之所以會增加，是因為該表面蛋白會參與粘連宿主細胞和生物膜形成的過程，而粘連的發(fā)生和生物膜的形成是腸球菌感染宿主細胞的關(guān)鍵步驟，所以隨著感染的發(fā)生，腸球菌表面蛋白的表達量也就隨之增加.但是，也有學(xué)者對這點提出了質(zhì)疑，Elhadidy 等［28］發(fā)現(xiàn)esp 基因與生物膜形成之間沒有必然的聯(lián)系，在38 株能夠形成生物膜的腸球菌中，有52.63 %(20/38)的腸球菌是不含有esp 基因的，另外，有2 株腸球菌雖具有esp 基因，但自身卻無法合成生物膜.目前盡管學(xué)者們對腸球菌表面蛋白的功能機理仍存在爭議，但可以肯定的是，腸球菌表面蛋白是一種毒力因子，會參與腸球菌感染致病的過程，同時機體也會產(chǎn)生相應(yīng)的免疫抗體，來減少腸球菌表面蛋白的形成［26-27］.

2.2.2 細胞溶素和明膠酶(Cytolysin and Gelatinase)

細胞溶素，又稱β-溶血素(β-hemolysin)，是腸球菌具有毒性的一個重要因素.一般認為，細胞溶素是由革蘭氏陽性細菌產(chǎn)生的二肽溶解毒素，與lantibiotics 和鏈球菌溶血素S 屬于同一家族，其不論是對原核細胞，還是真核細胞都能夠產(chǎn)生溶解現(xiàn)象［29］.

早在1984年，Ike 等［30］就提出細胞溶素是一種毒素的觀點，并證實了細胞溶素能夠?qū)π∈螽a(chǎn)生殺傷性.現(xiàn)在關(guān)于腸球菌毒性和細胞溶素之間的關(guān)系，已在不同的動物模型中得到了證實，如表3 所示.與此同時，人們還發(fā)現(xiàn)能夠合成細胞溶素的腸球菌往往也能夠合成聚合物.針對這一現(xiàn)象，F(xiàn)ranz 等［19］提出了一個可能性的解釋，即編碼細胞溶素和聚合物的基因位于同一個質(zhì)粒上.

表3 腸球菌細胞溶素在不同動物模型中的作用Tab. 3 The effect of the enterococcal cytolysin in different animal models

明膠酶，是由基因gelE 編碼合成的一種分泌蛋白酶，其操縱子frs 是編碼合成的關(guān)鍵因素，即使是在基因gelE 存在的情況下，若frs 缺失或者不完整，明膠酶的合成也會受到阻礙［34］.

關(guān)于明膠酶的毒性，目前一個比較公認的觀點是，明膠酶會參與生物膜的形成，同時，自身也可以降解宿主體內(nèi)的一些重要物質(zhì)，如組織中的明膠、膠原蛋白、纖維蛋白、內(nèi)皮縮血管肽、血管舒緩肽、抗菌肽和補體等.膠原蛋白和纖維蛋白的降解，會使得腸球菌離開最初的附著位點轉(zhuǎn)移或擴散到其他敏感性的位點;抗菌肽和補體的分解，可以使機體的免疫系統(tǒng)失效或者破壞［35］.另外需要注意的是，在腸球菌屬的范疇內(nèi)，基因gelE 的分布相當(dāng)廣泛.有數(shù)據(jù)［36］表明，在29 株肉源性腸球菌中，有58.63 %(17/29)的腸球菌具有g(shù)elE 基因，而其他毒力因子的基因分布率都低于50%.

2.2.3 過氧化氫調(diào)節(jié)因子(Hydrogen peroxide regulator)

一些研究表明過氧化氫調(diào)節(jié)因子與腸球菌的毒性是有關(guān)聯(lián)的.它屬于LysR 轉(zhuǎn)錄因子家族，是腸球菌氧化應(yīng)激反應(yīng)中的一個特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子.在此反應(yīng)中，腸球菌會產(chǎn)生并分泌抗活性氧的蛋白酶，使得活性氧失活，從而減少機體中巨噬細胞或中性粒細胞的免疫作用，因此，可以認為過氧化氫調(diào)節(jié)因子是有利于腸球菌抵抗機體的免疫系統(tǒng)，并提高其在機體內(nèi)的存活率和致病率［37］. 據(jù)Vernenil 等［38］研究表明，HypR 缺失性突變體，對過氧化氫高度敏感，也易被巨噬細胞吞噬消滅，同時，對小鼠的毒性也大大降低，與野生型相比，在感染120 h，小鼠的死亡率由100 %降低到了50 %.

2.2.4 莢膜多糖(Capsular polysaccharides)

許多致病微生物都能夠產(chǎn)生莢膜多糖，而莢膜多糖的存在可以幫助致病微生物躲避機體免疫系統(tǒng)的識別和清除，從而有利于微生物在宿主體內(nèi)的存活.糞腸球菌能夠產(chǎn)生4 種莢膜血清型A，B，C，D，而只有產(chǎn)血清型C 和D 的糞腸球菌，才能夠真正合成莢膜多糖［39］.Thurlow 等［40］表明由9 個基因(cpsC-cpsK)構(gòu)成的莢膜基因座是莢膜多糖形成的關(guān)鍵，而血清型C 和D 含有上述莢膜基因座的所有基因，并且cpsF 基因決定了血清型C 和D 的特異性.Thurlow 等［41］還認為腸球菌的莢膜多糖存在多個功能機制，如對機體調(diào)理性吞噬的抵抗以及腸球菌表面抗原的隱藏等.在抗體缺乏的情況下，調(diào)理素C3 會分裂成為C3b，這樣有利于調(diào)理素免疫功能的發(fā)揮，與缺乏莢膜的腸球菌相比，帶莢膜的腸球菌能夠通過抑制C3 和C3b 的積累和識別，從而有效地抑制機體的調(diào)理性吞噬;另外，機體體內(nèi)一般存在著一套免疫監(jiān)控體系，主要是通過病原菌識別受體(Pathogen recognition receptors，PRRS)來檢測和識別致病相關(guān)聯(lián)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，從而達到監(jiān)控目的，與腸球菌相關(guān)聯(lián)的PAMPs 是脂磷壁酸，而莢膜多糖的存在可以有效地隱藏腸球菌表面的脂磷壁酸，從而減少PRRS 對脂磷壁酸的識別，提高腸球菌在機體內(nèi)的存活率.

3 結(jié)論與展望

腸球菌能夠產(chǎn)生多種抑菌活性物質(zhì)，如乳酸、過氧化氫、細菌素和類細菌素等，而且不同的腸球菌可以產(chǎn)生不同類型的細菌素和類細菌素，因此，發(fā)現(xiàn)新穎并具有廣譜抑菌活性的細菌素或類細菌素是未來研究的主要方向之一.

另外，目前有兩種常規(guī)的方法可以將腸球菌應(yīng)用到日常飲食當(dāng)中:一種是直接將腸球菌加入到待加工的食品中，然后一起培養(yǎng)發(fā)酵;另一種是將純化或者半純化的抑菌物質(zhì)制成藥物或試劑.由于腸球菌有可能產(chǎn)生毒力因子，同時有可能對多種抗生素產(chǎn)生耐受性，所以，在直接使用腸球菌之前，需要對其進行安全性評價，而將腸球菌抑菌活性物質(zhì)進行分離和純化，則無需考慮腸球菌的安全性問題，因此，分離純化腸球菌抑菌活性物質(zhì)將是另外一個重要的研究方向.

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