基因沉默的工具－RNA干擾技術(shù)的研究進(jìn)展

趙雪萌 余祖江

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 感染科 河南 鄭州 450052)

RNA 干擾(RNA interference，RNAi)是指與靶基因序列同源的雙鏈RNA(dsRNA)所誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，是真核生物抵御病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動、調(diào)控基因表達(dá)的監(jiān)控機(jī)制，也可替代基因敲除、核酶、反義核酸等進(jìn)行基因沉默相關(guān)研究。眾所周知，基因的表達(dá)具有選擇性，我們發(fā)現(xiàn)生物體內(nèi)存在一套RNA 監(jiān)視系統(tǒng)，能通過多種途徑產(chǎn)生異常dsRNA，誘發(fā)RNAi，激活抑制基因，控制活躍基因，從而參與基因選擇性表達(dá)。目前RNAi 技術(shù)因其操作簡單、特異性強(qiáng)、高效性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物的抗病毒研究、藥物靶基因的篩選、腫瘤治療等領(lǐng)域［1］?，F(xiàn)對RNAi 的進(jìn)展做一綜述。

1 RNA 干擾的發(fā)現(xiàn)

RNAi 現(xiàn)象首次發(fā)現(xiàn)于植物中。1990年，Jorgensen 的實(shí)驗(yàn)室為使矮牽牛花的紫色花色加深而在植物中大量引入了同源編碼紫色的基因，但卻開出了白色或斑片狀的花朵。這種引入同源基因而致基因表達(dá)受抑制的現(xiàn)象在當(dāng)時(shí)被稱為共抑制［2］。1995年Younis 等［3］發(fā)現(xiàn)在秀麗新小桿線蟲中注射雙鏈RNA 后導(dǎo)致的基因沉默現(xiàn)象比注射單鏈正義或反義RNA 更為有效。隨后更多的研究表明，從線蟲到幾乎所有真核生物，包括原生動物，無脊椎動物，脊椎動物，真菌和藻類均存在這種現(xiàn)象［4－6］。這種引入雙鏈RNA 導(dǎo)致特異性基因沉默的現(xiàn)象被稱為“RNA 干擾”。后逐漸證實(shí)植物中的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)、共抑制(cosuppression)及病毒誘發(fā)的基因沉默、真菌的抑制(quelling)現(xiàn)象均屬于RNAi 在不同物種的表現(xiàn)形式。

2 RNA 干擾的機(jī)制

2.1 RNA 干擾過程 RNA 干擾過程包括起始階段和效應(yīng)階段［7］。在起始階段，dsRNA 在核酸酶(Dicer 酶)作用下切割成21 ～23 bp 雙鏈小分子干擾RNA(small interference RNA，siRNA)，在效應(yīng)階段與siRNA Agohaute 2 蛋白酶等結(jié)合，形成RNA 誘 導(dǎo) 的 沉 默 復(fù) 合 物(RNA－induced silencing complex，RISC)，隨后在ATP 提供能量及解旋酶的作用下雙鏈siRNA 解旋成單鏈，形成含單鏈siRNA 的RISC，又被稱為有活性的RISC?；罨腞ISC 與目標(biāo)mRNA 分子結(jié)合，抑制基因表達(dá)。同時(shí)研究表明siRNA 除了通過上述方式與mRNA 結(jié)合介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默外，還可以通過堿基配對原理，指導(dǎo)DNA 甲基化酶結(jié)合到DNA 特定部位，引發(fā)該部位DNA 中胞嘧啶的甲基化，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄水平基因沉默［8］。RNAi 作為體內(nèi)的監(jiān)視系統(tǒng)，通過上述兩種方式，積極參與了基因選擇性表達(dá)過程。

2.2 引發(fā)RNA 干擾的小分子來源 引發(fā)RNA 干擾的小分子RNA 有多種來源，主要分為內(nèi)源性和外源性。內(nèi)源性干擾小分子的代表micro RNA，為一種內(nèi)源性非編碼的21 ～25 bp 的單鏈RNA，是首先由細(xì)胞核內(nèi)非編碼RNA 在核酸酶的作用下形成前體miRNA(pri－miRNA)，后在Drosha 酶的作用下形成含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pri－miRNA，再在Dicer 酶作用下形成約22 nt的micro RNA。根據(jù)其與靶序列配對的程度，其作用方式包括兩種，如配對程度高則可以與mRNA 結(jié)合后使目的基因降解，如配對程度低則可結(jié)合mRNA 的3’UTP 部位抑制mRNA 的翻譯［9］。眾所周知，在生物體代謝過程中會產(chǎn)生大量無功能RNA(aberrant nonfunctional RNAs)，通過micro RNA 的清除或抑制作用，在基因水平上發(fā)揮了免疫監(jiān)視功能。

外源性干擾小分子即為siRNA，大致有3 種來源:①可以人工合成，包括體外人工合成一對序列互補(bǔ)的單鏈RNA(ssRNA)，導(dǎo)入體內(nèi)后退火形成dsRNA，也可通過構(gòu)建表達(dá)dsRNA的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入細(xì)胞表達(dá)dsRNA;②可通過RNA 依賴的RNA 聚合酶(RdRp)，識別異常的單鏈RNA(包括外來DNA 產(chǎn)生的RNA、病毒RNA 等)并以其為模板合成dsRNA 分子;③可以以干擾過程中RISC 剪切產(chǎn)生的siRNA 單鏈為引物，以mRNA 為模板合成dsRNA，這種過程被稱為隨機(jī)降解性多聚酶鏈反應(yīng)(random degradative PCR)［10－11］，是產(chǎn)生siRNA 干擾放大效應(yīng)的機(jī)制。siRNA 干擾本質(zhì)上就是由RNA 介導(dǎo)的獲得性免疫反應(yīng)，是生物體抵抗外來基因的一種保護(hù)機(jī)制。

2.3 RNA 干擾的作用特點(diǎn) RNAi 途徑主要存在于細(xì)胞漿中，與反義核酸、核酶相比，RNAi 具有以下特點(diǎn)。①特異性。siRNA 是嚴(yán)格按照堿基配對法則與靶mRNA 結(jié)合的，故只引起同源mRNA 的降解。研究表明，在siRNA 21 ～23 個(gè)堿基中，錯(cuò)配1 ～2 個(gè)堿基就會大大降低干擾效應(yīng)。②遺傳性。dsRNA 分子可擴(kuò)散至生物體各個(gè)細(xì)胞，干擾效應(yīng)可遺傳給后代。研究表明，通過注射或浸泡siRNA，在二代線蟲中仍可觀察到對靶基因的抑制作用［12］。但這種遺傳效應(yīng)可持續(xù)幾代以及高等細(xì)胞中是否也存在上訴現(xiàn)象尚不明確。③位置效應(yīng)。研究表明只有針對編碼區(qū)的dsRNA 才產(chǎn)生干擾效應(yīng)，對內(nèi)含子區(qū)域的dsRNA 不產(chǎn)生干擾效應(yīng)［13］。Kesharwani 等［14］根據(jù)人組織因子(human tissue factor，hTF)的不同位置合成了四組雙鏈RNA 分別觀察其干擾效應(yīng)，結(jié)果顯示hTF167I 和hTF372I 有85% ～90%的基因沉默效率，hTF562I 只能抑制部分基因，hTF478I 幾乎無干擾效應(yīng)。④放大效應(yīng)。通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，少量dsRNA就能夠使大量目的基因沉默，即使細(xì)胞增殖50 ～100 倍，這種沉默現(xiàn)象仍然存在，表明RNAi 存在擴(kuò)增機(jī)制。

3 RNA 干擾的應(yīng)用

3.1 基因研究新工具 通過RNAi 特異性抑制目的基因表達(dá)，從而了解該基因的功能，擴(kuò)展基因文庫，是RNA 干擾技術(shù)開展后最開始的應(yīng)用方向。Yu 等［15］通過構(gòu)建cyclin D1 的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，抑制cyclin D1 基因的表達(dá)，研究該基因?qū)︸：鄹泶癯衫w維細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期變化。同時(shí)RNA 干擾在信號傳導(dǎo)通路的研究進(jìn)展中功不可沒。通過利用RNA 干擾技術(shù)進(jìn)行基因組功能的分析可迅速建立基因與表型的關(guān)系，大大縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，隨著RNAi 技術(shù)的不斷完善，它必將成為基因研究的強(qiáng)力工具。

3.2 疾病治療的新方法 RNAi 技術(shù)還被廣泛應(yīng)用于腫瘤、病毒感染、遺傳病等方面。Brummelkamp 等［16］將siRNA 導(dǎo)入人的胰腺癌細(xì)胞，特異性地抑制K－RASV12 的表達(dá)，使腫瘤的生長速度及惡性程度降低。對于基因突變引起的難治性遺傳病如舞蹈病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥，通過RNA 干擾技術(shù)，也可達(dá)到降低突變基因表達(dá)，改善病情的效果。Novina 等［17］通過針對HIV 受體CD14 和CCR5 設(shè)計(jì)siRNA，減少受體的表達(dá)，從而減少HIV 病毒感染。RNAi 作為新的抗病毒治療武器，也應(yīng)用于脊髓灰質(zhì)炎病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒等研究中。RNAi 的大力發(fā)展，為疾病的治療提供了新的策略。

3.3 藥物開發(fā)及應(yīng)用 近期研究表明，RNAi 還被應(yīng)用于篩選藥物及鑒定藥物作用靶點(diǎn)。Duff 等［18］通過RNAi 技術(shù)減少蛋白轉(zhuǎn)移酶9(PCSK9)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)能有效降低小鼠血清膽固醇水平，說明沉默PCSK9 可成為治療高膽固醇的藥物靶點(diǎn)。在藥物篩選方面，有研究通過shRNA 發(fā)現(xiàn)維甲酸類藥物能增強(qiáng)pk11 激酶抑制劑的抑制作用，加速癌細(xì)胞凋亡［19］。Zhou 等［20］的研究表明，Akt 是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，與胃癌化療敏感性有關(guān)，通過RNA 干擾技術(shù)將Akt1 沉默慢病毒轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞株SGC－7901 和BGC－823，發(fā)現(xiàn)可顯著提高對順鉑的敏感性。RNAi 的應(yīng)用能明顯縮短藥物從開發(fā)到篩選出最有效藥物的時(shí)間，在藥學(xué)領(lǐng)域具有不可磨滅的功勞。

4 存在的問題

RNA 干擾應(yīng)用廣泛，但在臨床應(yīng)用時(shí)還存在幾個(gè)重要障礙需要克服，包括先天免疫的激活、RNA 脫靶效應(yīng)、劑量的調(diào)節(jié)及載體的選擇等［21］。

合成的siRNA 在哺乳動物內(nèi)能夠激活天然免疫系統(tǒng)，通過刺激細(xì)胞質(zhì)的模式識別受體，如雙鏈RNA 依賴的蛋白激酶(PKR)，視黃酸誘導(dǎo)的基因Ⅰ(RIG－Ⅰ)和Toll 樣受體(TLR)等，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的激活(如TNF－α、IL－6)及干擾素反應(yīng)(如IFN－α、IFN－β)，造成機(jī)體損傷。同時(shí)siRNA 也可引起一些非靶基因的非特異性沉默或表達(dá)上調(diào)，引起細(xì)胞的凋亡或生長抑制，這種現(xiàn)象被稱為脫靶現(xiàn)象(off－target phenomenon)，目前考慮可能是外源性siRNA 誘發(fā)干擾素通路引起，或非靶基因具有的部分互補(bǔ)序列介導(dǎo)mRNA 降解［22－23］。在科研過程中siRNA 劑量的調(diào)節(jié)及載體的選擇一樣為我們帶來了困擾，siRNA 具有高效性，較低濃度的siRNA 就能抑制靶基因表達(dá)，且研究表明siRNA 的干擾效應(yīng)隨其濃度的增加而增強(qiáng)，但過量的siRNA 不僅會導(dǎo)致與非靶mRNA 不完全互補(bǔ)配對的概率增加，同時(shí)可誘發(fā)更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，我們稱為siRNA 的毒性。目前試驗(yàn)使用的最低有效濃度可達(dá)10 nM，不同細(xì)胞的有效濃度不同。siRNA 導(dǎo)入細(xì)胞的效率很低，現(xiàn)階段最常見的載體有病毒載體、脂質(zhì)體，其他載體介導(dǎo)如磷酸鈣共沉淀等，目前應(yīng)用最廣泛的是脂質(zhì)體，更多的轉(zhuǎn)染方法等待我們進(jìn)一步的研究。

5 展望

自RNA 干擾技術(shù)問世以來，這種分子干預(yù)方式已廣泛應(yīng)用于體外、體內(nèi)基因的選擇性表達(dá)，以及腫瘤、病毒感染等疾病的治療，尤其是其在藥物開發(fā)方面提供了新的思路，縮短了藥效測試時(shí)間，并為多重耐藥患者帶來了福音。盡管在臨床應(yīng)用中，RNA 干擾存在免疫激活、脫靶現(xiàn)象等，我們相信這些問題最終會得到解決，RNA 干擾技術(shù)必將更為廣泛地應(yīng)用到基礎(chǔ)研究、臨床藥物應(yīng)用等方面，也必將成為人類基因組學(xué)研究的革命性工具。

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