DNA甲基化與皮膚腫瘤的研究進展

曾穎 康曉靜

DNA甲基化與皮膚腫瘤的研究進展

曾穎 康曉靜

DNA甲基化是表觀遺傳學的重要內(nèi)容之一，該DNA修飾方式在不改變基因序列的前提下實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控。多項研究證實，DNA甲基化異常與黑素瘤、皮膚基底細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌、皮膚T細胞淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)，而DNA甲基化檢測技術(shù)為檢測DNA甲基化提供技術(shù)平臺。通過甲基化檢測技術(shù)分析基因異常甲基化已成為當前皮膚腫瘤早期診斷、治療、預(yù)后評估等的方向。

DNA甲基化；黑色素瘤；腫瘤,基底細胞；腫瘤，鱗狀細胞；淋巴瘤，T細胞

隨著表觀遺傳學研究的進一步發(fā)展，大量研究提示，皮膚腫瘤中存在DNA異常甲基化。DNA異常甲基化影響癌基因和抑癌基因的表達以及基因組的穩(wěn)定性，從而導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展，DNA甲基化檢測技術(shù)彌補了傳統(tǒng)檢測方法耗時長且不能大規(guī)模分析的缺點，為皮膚腫瘤的表觀遺傳學機制及大規(guī)模表觀遺傳學標志物的探尋和發(fā)現(xiàn)提供了高效的技術(shù)平臺。

1 DNA甲基化

DNA甲基化為最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，是指在甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，DNA的CG兩個核苷酸的胞嘧啶被選擇性地添加甲基，形成5甲基胞嘧啶，參與基因轉(zhuǎn)錄抑制、基因組印跡、X染色體失活、染色質(zhì)完整性的維持、細胞分化和發(fā)育調(diào)控等生物學過程［1］。DNA甲基化主要發(fā)生在富含胞嘧啶（C）和鳥嘌呤（G）的CpG島區(qū)域。DNA甲基化導致腫瘤發(fā)生的主要機制為：①抑癌基因啟動子區(qū)被異常甲基化，基因表達沉默進而導致腫瘤發(fā)生［2］；②細胞周期調(diào)控基因甲基化異常，細胞調(diào)控周期紊亂使腫瘤細胞增殖過速；③腫瘤侵襲相關(guān)基因甲基化異常使腫瘤擴散轉(zhuǎn)移，DNA損傷修復基因異常甲基化使腫瘤發(fā)生率增加［3］。

2 DNA甲基化與皮膚腫瘤

2.1 DNA甲基化與黑素瘤：黑素瘤起病隱匿、發(fā)展迅速，早期可通過手術(shù)治療，發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者對放化療均不敏感，平均生存期2～8個月，5年生存率不足5%［4］。黑素瘤轉(zhuǎn)移性強，據(jù)統(tǒng)計，2013年美國有9 480 例死于該?。?］。2009年，Tellez等［6］發(fā)現(xiàn) 15 種腫瘤相關(guān)基因的高甲基化與黑素瘤發(fā)生密切相關(guān)Fibulin-1（FBLN1）是 Wu 等［7］在2013年發(fā)現(xiàn)的一種新的腫瘤抑制基因，通過甲基化特異性PCR進行FBLN1甲基化狀態(tài)研究，發(fā)現(xiàn)皮膚黑素瘤組織中啟動子甲基化率明顯高于瘤旁正常皮膚組織，F(xiàn)BLN1下調(diào)與啟動子甲基化密切相關(guān)，該基因啟動子區(qū)CpG島發(fā)生高甲基化時FBLN1表達沉默進而導致黑素瘤的發(fā)生，同時Kaplan-Meier分析顯示，在皮膚黑素瘤患者中，F(xiàn)BLN1基因甲基化狀態(tài)與總生存期呈負相關(guān)，因此，F(xiàn)BLN1基因啟動子區(qū)域高甲基化可提供預(yù)后的潛在生物標志物，并可作為總體生存期的獨立預(yù)測指標。

作者單位：830001烏魯木齊，新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科（曾穎、康曉靜）；石河子大學醫(yī)學院研究生院（曾穎）

黑素瘤腦轉(zhuǎn)移是皮膚黑素瘤常見并發(fā)癥，其生存期不足1年。DNA甲基化是腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的一個重要標志，Marzese等［8］發(fā)現(xiàn)，黑素瘤腦轉(zhuǎn)移與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的基因存在差異甲基化CpG位點。所有異常甲基化基因中HOX家族成員受影響最為顯著，黑素瘤腦轉(zhuǎn)移患者中，HOXD9基因表達明顯增高，且該基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平高。HOXD9基因啟動子區(qū)有一個特定的部分甲基化區(qū)域，此區(qū)域高水平甲基化促進HOXD9主動表達、組蛋白修飾及增強轉(zhuǎn)錄活性，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。通過隨訪及多元分析，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者HOXD9高甲基化死亡風險比HOXD9基因去甲基化高2.7倍，表明HOXD9甲基化狀態(tài)可能影響黑素瘤患者的預(yù)后。

Gao等［9］通過基因芯片技術(shù)對皮膚原發(fā)性黑素瘤和良性色素痣的14 495個基因進行全基因組DNA 甲 基 化 分 析 ，HOXA9、CDH11、PLEKHG6、MAPK13、PPP1R3C和CLDN11被確定為頻發(fā)高甲基化基因。其中編碼p38δ的MAPK13抑癌基因在原發(fā)黑素瘤中甲基化狀態(tài)為67%，在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中為85%。p38 MAPK信號通路的激活環(huán)境和基因毒性應(yīng)激，影響細胞的增殖、活化、分化、遷移。該實驗用5′-氮雜-2′-脫氧胞苷處理高甲基化的黑素瘤細胞株后，通過實時熒光定量PCR分析，MAPK13表達增強，其編碼的蛋白表達增加，黑素瘤細胞增殖受限，該研究表明，基因沉默可以加速黑素瘤進展，與預(yù)后不良有關(guān)，同時MAPK13異常甲基化可作為診斷皮膚原發(fā)性黑素瘤和良性色素痣的一個鑒別指標。

再生基因1A（REG1A）在組織再生和細胞增殖上皮來源的腫瘤中起重要作用。Sato等［10］研究發(fā)現(xiàn)，黑素瘤術(shù)后輔助化療患者中REG1A表達高者預(yù)后更好，而REG1A表達低者則預(yù)后較差，從而得出REG1A表達情況可作為判斷黑素瘤患者化療敏感性的一個生物標志。REG1A基因啟動子區(qū)表觀遺傳調(diào)控，可為轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者提供一個增強化療敏感性的潛在治療方法。Hou等［11］采用甲基化CpG島擴增/CpG島微陣列技術(shù)，發(fā)現(xiàn)BRAF V600E抑制狀態(tài)下的細胞系部分基因甲基化狀態(tài)降低，得出BRAF V600E能發(fā)出甲基化突變信號促進相應(yīng)基因甲基化，使絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路活化，提高黑素瘤的致癌活性。因此，阻斷該信號有望成為一個治療新靶點。

2.2 DNA甲基化與皮膚基底細胞癌（BCC）：BCC是白種人中最常見的皮膚腫瘤［12］。BCC的發(fā)生與多種癌基因、抑癌基因以及凋亡調(diào)控基因的表達異常有關(guān)，如 FHIT、PTCH1、PTEN、p53、p16、Bcl-2 等。Goldberg等［13］在BCC患者中通過甲基化特異性PCR，結(jié)合亞硫酸氫鹽的依賴限制性分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)HIT腫瘤抑制基因啟動子的超甲基化頻率高達88%，其編碼的FHIT蛋白表達全部缺失。FHIT基因?qū)儆诮M氨酸三聯(lián)體基因家族，該研究顯示，F(xiàn)HIT基因可能通過調(diào)控細胞周期，誘導細胞凋亡發(fā)揮抑制腫瘤的作用。其失活機制主要表現(xiàn)為啟動子區(qū)域CpG島甲基化、FHIT缺失及異常轉(zhuǎn)錄。人FHIT蛋白具有AP3A水解酶活性，F(xiàn)HIT基因異常甲基化時其水解酶活性喪失將導致AP3A或其類似物在體內(nèi)積累，刺激DNA聚合酶α合成DNA，使細胞通過細胞周期G1期控制點進入S期，也可能該水解酶失活后細胞對外界環(huán)境的應(yīng)激能力下降而惡變［14］。由于FHIT基因的異常甲基化導致了FHIT基因沉默，促進了BCC的發(fā)生。Stamatelli等［15］用17例石蠟包埋BCC組織及35例新鮮BCC組織標本與26例新鮮正常組織進行對照，目的是為了解前述基因啟動子甲基化與腫瘤臨床病理特點及增殖方式等的相關(guān)性。經(jīng)甲基化特異性PCR及高分辨率熔解分析法研究得出，癌基因 DCR2、APC、DCR1、RASSF1、DAPK啟動子區(qū)域甲基化可變頻率為44%、33%、32.5%、32%、14%。研究得出結(jié)節(jié)性BCC比淺表性BCC更容易出現(xiàn)多個基因啟動子區(qū)域甲基化。

2.3 DNA甲基化與皮膚鱗狀細胞癌（SCC）：在癌細胞中,抑癌基因啟動子區(qū)異常甲基化，基因表達沉默從而導致皮膚 SCC 發(fā)生［16］。Nandakumar等［17］通過DNA甲基化定量試劑盒測定皮膚SCC中DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)抑癌基因p16INK4a和Cip1/p21啟動子區(qū)域高甲基化，為此他們使用表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）通過A431細胞觀察抑癌基因高甲基化逆轉(zhuǎn)情況，最終得出EGCG可以恢復或重新激活的DNA甲基化沉默基因p16INK4a和Cip1/p21的表達，可使SCC細胞轉(zhuǎn)移酶活性下降，降低5甲基胞嘧啶的水平，提高mRNA及抑癌基因蛋白表達水平。因此，p16INK4a和Cip1/p21甲基化情況可提示療效及評估預(yù)后。

2.4 DNA甲基化與皮膚T細胞淋巴瘤（CTCL）：CTCL原發(fā)于皮膚，可累及淋巴組織、外周血及內(nèi)臟。研究發(fā)現(xiàn)，凋亡途徑異常也能誘導CTCL的發(fā)生。在淋巴樣細胞中有幾個潛在凋亡途徑，包括外在死亡受體途徑，如Fas、腫瘤壞死因子和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體受體，以及內(nèi)在的線粒體途徑。公認的T細胞主要凋亡機制是Fas途徑,而Fas啟動子區(qū)域存在多個CpG島，啟動子異常甲基化可以抑制Fas轉(zhuǎn)錄、蛋白表達，降低細胞凋亡敏感性，最終導致腫瘤發(fā)生。為了探索CTCL中Fas啟動子甲基化、細胞表面Fas蛋白水平及Fas途徑介導的細胞凋亡敏感性之間的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)，在緊接第一外顯子上游約1.8 kb的Fas啟動子區(qū)域顯示37個CpG島，且分布在MyLa、Hut-78、HH和SZ4四部分，并且確定了每部分的甲基化水平，MyLa和Hut-78中Fas mRNA及細胞表面蛋白高水平表達，而HH和SZ4則低水平表達。表達低水平Fas的HH和SZ4與表達高水平Fas的MyLa和Hut-78有6個相關(guān)CpG島高甲基化，用5氮胞苷去甲基化可使Fas表達上調(diào)，而此處理對MyLa和Hut-78的影響不大，可HH和SZ4中啟動子甲基化降低的同時還伴隨著Fas mRNA及細胞表面蛋白表達顯著增加，因此，CTCL中啟動子甲基化調(diào)節(jié)Fas表達。該實驗還用甲氨蝶呤作為DNA甲基化消耗劑的甲基供體，在治療CTCL患者時使用甲氨蝶呤與α干擾素，刺激Janus激酶和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK-STAT）這兩個信號轉(zhuǎn)導途徑，使DNA去甲基化上調(diào)Fas，增強Fas蛋白表達與Fas途徑的細胞凋亡，為CTCL的治療提供新方法［18］。

3 結(jié)語

基因啟動子區(qū)異常甲基化檢測手段日益完善，皮膚腫瘤相關(guān)基因異常甲基化成為目前研究的焦點。隨著對表觀遺傳學研究的深入以及新腫瘤候選基因的發(fā)現(xiàn)，DNA異常甲基化可作為腫瘤發(fā)生的生物指標，同時與其他標志物如基因突變等共同分析，將有利于提高腫瘤診斷的特異性，同時為腫瘤治療及預(yù)后評估提供依據(jù)。

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DNA methylation and skin neoplasms

Zeng Ying,Kang Xiaojing.Department of Dermatology and Venereology,People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830001,China

DNA methylation,an important component of epigenetics,can regulate gene expression without changing the gene sequence.In recent years,several studies have proved that the abnormity of DNA methylation is closely related to the development of melanoma,cutaneous basal cell carcinoma,cutaneous squamous cell carcinoma and cutaneous T cell lymphoma.The development of technologies has greatly facilitated the detection of DNA methylation.Analyzing aberrant methylation of genes by using methylation detection technologies has become a new direction in early diagnosis,treatment and evaluation of prognosis of skin neoplasms.

DNA methylation;Melanoma;Neoplasms,basal cell;Neoplasms,squamous cell;Lymphoma,T-cell

Kang Xiaojing,Email:drkangxj666@163.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.04.014

新疆維吾爾自治區(qū)國際科技合作計劃項目（20146022）

康曉靜，Email:drkangxj666@163.com

本文主要縮寫：REG1A：再生基因1A，MAPK：絲裂原活化蛋白激酶，BCC：基底細胞癌，SCC：鱗狀細胞癌，EGCG：表沒食子兒茶素沒食子酸酯，CTCL：皮膚T細胞淋巴瘤

2014-10-21）