回復鑲嵌現(xiàn)象與隱性營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥治療的研究進展

柳琦 張汝芝

回復鑲嵌現(xiàn)象與隱性營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥治療的研究進展

柳琦 張汝芝

隱性營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥是一種遺傳性水皰病，由編碼Ⅶ型膠原的基因突變引起，對患者生活質量有很大影響，目前治療多為對癥處理，迫切需要更好的治療方法。近年研究發(fā)現(xiàn)，隱性營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥患者存在回復突變所致的片狀外觀正常皮膚。這種現(xiàn)象稱為回復鑲嵌現(xiàn)象，也稱為天然基因治療。這一發(fā)現(xiàn)開啟了回復細胞治療的可能性，即回復的角質形成細胞體外培養(yǎng)移植到受損皮膚。假如結合患者特異性誘導性多能干細胞方法，可以有機會培養(yǎng)出大片健康皮膚移植物。另外，回復體來源的誘導性多能干細胞還可以分化為造血細胞和間質干細胞，骨髓移植后歸巢到水皰區(qū)域，即“從皮膚到血細胞，再修復皮膚”。

營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解；皮膚疾病，水皰大皰性；鑲嵌現(xiàn)象；遺傳現(xiàn)象；多能干細胞；治療應用

隱性營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥（RDEB）是一種少見的常染色體隱性遺傳性皮膚病，其發(fā)生是由于編碼Ⅶ型膠原（Col17）的基因突變。Col17是基底膜帶處固著性原纖維的主要成分，而固著性原纖維參與表皮和其下真皮的黏附，使得皮膚功能完整。Col17的缺乏使得皮膚脆弱、水皰形成和糜爛［1］。因此，RDEB患者的皮膚和口腔、胃腸道、泌尿生殖道黏膜反復發(fā)生水皰，最終，水皰愈合留下瘢痕，導致嚴重的畸形。如果繼發(fā)感染，可導致敗血癥或多器官衰竭。轉移性鱗狀細胞癌是RDEB患者最常見的死亡原因。目前，RDEB的治療主要是對癥治療和創(chuàng)傷護理，如止痛包扎、營養(yǎng)支持和抗感染等。臨床研究發(fā)現(xiàn)，RDEB患者存在從未發(fā)生水皰的皮膚，這些皮膚中存在回復體（revertant）細胞，這些細胞有自發(fā)性矯正的 Col17A1 基因，并表達 Col17［2］。

1 回復體及回復鑲嵌現(xiàn)象

1.1 回復體：回復體來自拉丁語revertere，意味著回到原來的狀態(tài)，是一種軀體細胞內致病突變的自發(fā)性矯正。發(fā)生機制包括逆突變（back mutation）、基因轉換、基因內重組和第二位點突變等［3］。逆突變指致病突變變成野生型序列，恢復了野生型蛋白質的翻譯。逆突變是隨機的，可能是基因的不穩(wěn)定性導致突變率增加，或者受環(huán)境因素的影響，如長期暴露于紫外線。基因轉換指遺傳物質從供體序列到高度同源的受體序列的轉移，單向而非相互，導致受體序列部分或全部被供體序列替換，而供體序列保持不變?；騼戎亟M涉及遺傳物質在供體和受體間相互轉移，導致其中一個子代細胞攜帶源于親代的兩種致病突變，而另一個回復性子代細胞不攜帶致病突變［4］。第二位點突變是一種自發(fā)補償性突變，發(fā)生在致病移碼的上游或下游，從而恢復閱讀框，產生的蛋白質類似于野生型或者盡管有功能但與野生型相比略有不同［5］。其他回復體機制還包括反轉錄轉座子和DNA滑動?；貜涂梢园l(fā)生在生殖細胞或體細胞內，若發(fā)生在生殖細胞內，則可以傳遞給子代。

1.2 回復鑲嵌現(xiàn)象（revertant mosaicism，RM）：RM是指攜帶種系突變的細胞和已經矯正種系突變的回復細胞共存。最初認為RM是一種罕見的現(xiàn)象，但最近研究表明，RM并不少見。盡管RM首次在RDEB患者身上發(fā)現(xiàn)，但并不是RDEB所特有的，在其他疾病中亦可見，如原發(fā)性免疫缺陷病、范可尼貧血、魚鱗病、杜氏肌營養(yǎng)不良癥和酪氨酸血癥等［6］。據報道，Wiskott-Aldrich綜合征中RM的發(fā)生率達11%（30/272例），范可尼貧血中達18% （5/28例），非Herlitz交界性大皰性表皮松解癥（JEB-nH）中達35%（7/20例）［4］。RM似乎在再生器官系統(tǒng)的遺傳性疾病中很普遍，如皮膚、肝臟和造血系統(tǒng)等［7］，回復細胞類型包括肝細胞、淋巴細胞、肌細胞、成纖維細胞（FB）和角質形成細胞（KC）等［5］。

2 RM在RDEB治療中作用

2.1 RDEB治療：RDEB尚無確定的治療方法，只是對癥處理和創(chuàng)傷護理，如止痛包扎、營養(yǎng)支持和抗感染等。隨著對RDEB發(fā)病機制及遺傳基因等方面的深入研究，在治療方面已取得了重大進展，包括基因治療（載體介導、基因重編程和基因沉默）、蛋白替代療法、細胞治療（系統(tǒng)應用骨髓干細胞移植、間充質干細胞、局部應用KC和FB、培養(yǎng)/移植回復性細胞）以及應用誘導性多能干細胞（iPSC）等［8］。雖然這些治療為患者帶來了希望，但大部分仍存在許多亟待解決的問題，如病毒或非病毒介導的基因治療可能導致插入性突變或致癌作用，蛋白療法或異體細胞治療可能引起免疫排斥反應等［9］。

1例36歲非Herlitz交界性大皰性表皮松解癥患者被成功移植LAMB3 cDNA（反轉錄病毒攜帶）修正的表皮片，并維持功能性表皮，顯示遺傳性皮膚病體外基因治療的可行性，但該方法的安全性有待考證［10］。由于不能識別和靶向干細胞（能重建皮膚所有組分），基因導入效率低下，因此，基因矯正治療遺傳性皮膚病面臨很大困難。

2.2 皮膚RM的首次發(fā)現(xiàn)：首次報告的皮膚RM出現(xiàn)在28歲泛發(fā)性萎縮性良性大皰性表皮松解的女性患者，該報道首次表明了在遺傳性疾病中體細胞基因轉換的作用。此例患者有兩個COL17A1突變的復合雜合子，即母系遺傳的移碼突變c.1706delA和父系遺傳的無義突變p.Arg1226X。臨床上出現(xiàn)多片外觀正常的皮膚，對稱性分布于上肢的伸側。受累皮膚內未檢測到Ⅶ型膠原，但在回復皮膚中，熒光顯微鏡觀察到Ⅶ型膠原的鑲嵌型。從回復體細胞提取DNA，進行序列分析，顯示父系遺傳的突變，但不存在母系遺傳的突變，提示這些KC中的逆突變抵消了母系突變［11］。

2.3 回復體細胞移植治療 RDEB：Gostynski等［12］利用膠帶剝離法成功治療1例鑲嵌性Ⅶ膠原缺陷的JEB-nH患者?；顧z獲取患者左腕部表型正常的含回復體細胞的皮膚，胰酶消化獲得KC，接種于飼養(yǎng)層細胞上，5周后獲得所需移植細胞片。作為受皮區(qū)的右股部，乙醚脫脂后，用聚丙烯酸脂膠帶粘貼，然后輕輕撕去粘有表皮的膠帶，露出無血的創(chuàng)面裸露的致密板，整個操作要求無菌。此方法簡單有效、耐受性強、無痛。移植后4個月后隨訪，移植區(qū)上皮化，無瘢痕，有輕度線狀色素沉著，顯示移植成功，然而，因移植物中存留的回復體細胞少于3%，因此沒有達到功能性修復。

2.4 回復體細胞移植的局限性：研究表明，人們可以利用RM中的回復體細胞治療遺傳性水皰性皮膚病的創(chuàng)面，但是，由于以下可能的原因導致移植物中回復性細胞比例較低：①高度增殖的回復體細胞可能在RM中被逐漸耗竭；②分離出回復體細胞僅能有限傳代，即衍生的細胞數有限；③通常皮膚黏膜創(chuàng)傷不容易獲得，故局部創(chuàng)傷治療不能提供理想的治療方法［13］。因此，為解決這些問題，人們推測，可以通過體外建立穩(wěn)定的干細胞來源，以分化為目標KC，用于基因校正以達到治療此病的目的。

3 RM結合iPSC技術治療RDEB

RM結合iPSC技術治療RDEB，是一種新思路。將RDEB患者的回復性細胞重編程為基因矯正的iPSC，然后將這種回復性iPSC分化成目標細胞，產生皮膚類似物用于RDEB自身的全身或局部治療，可能降低RDEB患者的并發(fā)癥、提高生存期和改善生活質量等。

3.1 患者特異性iPSC的研究現(xiàn)狀：Itoh等［14］從2例RDEB男患兒（年齡分別為13個月和1.5歲）的正常皮膚的真皮獲取FB，原代培養(yǎng)后，用c-MYC、SOX2、OCT4和KLF4因子轉導，產生患者特異性iPSC（PS-iPSC），對PS-iPSC進行突變和指紋分析后，體外分化培養(yǎng)，獲得KC，成功構建了三維皮膚類似物。作者的研究還顯示，這些PS-iPSC分化的FB也能產生Col17，提示FB也可作為治療RDEB的細胞來源之一［15］。既然 FB和 KC均能分泌Col17，意味著這兩種細胞的表型似乎都與RDEB發(fā)病有關。Tolar等［16］從3例RDEB患者的正常皮膚中獲取FB和KC，并成功重編程為PS-iPSC，這些細胞肌內注射給免疫缺陷鼠，可生成畸胎瘤；體外可分化成造血細胞；用包含人Col17A1基因的質粒轉染該PS-iPSC，可獲得基因修正。

3.2 PS-iPSC的潛能：PS-iPSC的獲取使得人們更好地理解在上皮干細胞、祖細胞及其子代細胞發(fā)育中，Col17缺陷引發(fā)的下游事件。RDEB患者皮膚FB和KC來源的PS-iPSC體外可分化成造血和非造血細胞。這些研究結果強調了RDEB來源的PS-iPSC的潛能：①RDEB來源的PS-iPSC顯示疾病相關表型，提供研究RDEB和相關疾病發(fā)生機制的模型［15］，與分化的人類細胞和RDEB動物模型相比，PS-iPSC更有優(yōu)越性，提供機會更深入分析Col17缺陷的細胞效應，不依賴于糜爛和水皰形成時系統(tǒng)炎癥反應的繼發(fā)效應；②使用已知基因糾正的PS-iPSC（來自RM）產生自體造血移植物，用作系統(tǒng)治療；③產生皮膚細胞治療RDEB患者皮膚和黏膜的損傷［13］。這一技術在理論上可以獲得用之不竭的患者特異性回復性細胞，無需基因矯正，能夠克服基因治療、異體細胞療法等治療方案可能帶來的弊端。

3.3 RM結合PS-iPSC應用的受限因素：RM結合PS-iPSC治療RDEB的潛在風險與下列因素有關：①用胚胎干細胞特異性的轉錄因子重編程，可能有基因毒性，重編程方法使得突變基因增強（如病毒載體輸入）；②獲得和維持多能表型和種系特異性細胞命運的可信度；③分化的PS-iPSC子代的純度，最少化或避免未分化和潛在致瘤iPSC的存在［16］。

4 結語

RM這一天然基因治療為RDEB帶來了曙光，但因其明顯的局限性：回復性KC和干細胞數量有限，無法真正改善患者的生活質量，因此，僅憑借RM治療RDEB仍然十分困難。隨著研究的進展，人們利用嘗試RM聯(lián)合iPSC技術，將Col17A1回復性KC或FB誘導為功能性iPSC，然后將此功能性iPSC分化成目標細胞，并進行擴增，用于局部或全身治療。隨著對RDEB的不斷深入研究和分化、移植、iPSC等技術的不斷成熟，RM聯(lián)合iPSC技術可能為未來治療RDEB提供一種有前景的治療方法。

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Revertant mosaicism and treatment of recessive dystrophic epidermolysis bullosa

Liu Qi,Zhang Ruzhi.Third Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 213003,China

Recessive dystrophic epidermolysis bullosa （RDEB）,an inherited blistering disease caused by mutations in the gene encoding typeⅦ collagen,has a strong impact on patients′quality of life.At present,it is mainly managed by symptomatic treatment,and more effective therapeutic approaches are urgently needed.Recent studies have found the presence of patches of normal-looking skin caused by reverse mutations in patients with RDEB.This phenomenon is called revertant mosaicism,also known as “natural gene therapy”.This finding offers the possibility of revertant cell therapy,namely,transplantation of revertant keratinocytes culturedin vitroonto damaged skin.The combination with patient-specific induced pluripotent stem cells（iPSCs） makes it possible to harvest large sheets of healthy skin graft.Moreover,iPSCs derived from revertant keratinocytes can differentiate into hematopoietic cells and mesenchymal stem cells,which can home to blistering areas after bone marrow transplantation,namely,“from skin to blood cells,then to repair of skin”.

Epidermolysis bullosa dystrophica;Skin diseases,vesiculobullous;Mosaicism;Genetic phenomena;Multipotent stem cells;Therapeutic uses

Zhang Ruzhi,Email:zhangruzhi628@163.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.02.012

國家自然科學基金（81171516）

213003蘇州大學附屬第三醫(yī)院

張汝芝,Email:zhangruzhi628@163.com

本文主要縮寫：RDEB：隱性營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥，RM：回復鑲嵌現(xiàn)象，F(xiàn)B：成纖維細胞，KC：角質形成細胞，iPSC：誘導性多能干細胞

2014-05-09）