蒜瓣浸出液抗柔嫩艾美耳球蟲效果研究

劉立恒　羅鋒　吳家斌

摘要：為了考察大蒜浸出液在抗雞球蟲臨床上的應(yīng)用。試驗設(shè)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組，第Ⅰ組：卵囊分別投入50%、20%、10%的蒜瓣浸出液、2.5%重鉻酸鉀液中，恒溫培養(yǎng)24、48、72 h后計算卵囊孢子化率。第Ⅱ、Ⅲ組：分別以50%蒜瓣浸出液抑殺的未孢子化、孢子化卵囊，恒溫培養(yǎng)48 h洗凈感染1×105個/只卵囊；第Ⅳ組：感染1×105個/只孢子化卵囊，以20% 的蒜瓣浸出液作為驅(qū)蟲中藥替代飲水；第Ⅴ組：感染1×105個/只孢子化卵囊后不給藥；第Ⅵ組：不感染不給藥。結(jié)果表明，50%、20%濃度蒜瓣浸出液于24、48、72 h后卵囊孢子化率與對照組差異均顯著（P<0.05）；以第Ⅱ組雛雞的平均增重及相對增重率最高，組間差異不顯著，與感染對照組（Ⅴ）差異顯著；第Ⅲ組平均OPG數(shù)僅次于感染對照組（Ⅴ），遠高于Ⅱ、Ⅳ組差異顯著；第Ⅱ、Ⅳ組卵囊比值在25%～50%區(qū)間，卵囊值均為10；第Ⅲ組卵囊比值在75%～100%區(qū)間，卵囊值為40；第Ⅲ、Ⅴ組部分雞只出現(xiàn)血便；第Ⅲ組病變值（11.7）僅次于第Ⅴ組（23.3），第Ⅲ、Ⅳ組間差異顯著；在第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ3組中，ACI以第Ⅱ組（173.95）為最高，第Ⅳ組次之，2組均判為中等效果。第Ⅲ組ACI為117.55，小于120判為無效。蒜瓣浸出液對體外抑殺未孢子化卵囊感染、體內(nèi)阻斷球蟲發(fā)育效果較好。

關(guān)鍵詞：蒜瓣；抗柔嫩艾美耳球蟲；效果

中圖分類號：S852.72+3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0134-03

隨著養(yǎng)雞業(yè)的不斷發(fā)展，抗雞球蟲病的藥物效果、藥物抗藥性、藥物殘留或雞產(chǎn)品食用安全越來越受到關(guān)注[1，2]。中草藥具有抑殺球蟲和毒副作用小、增強機體免疫功能及促生長等優(yōu)點，尤其是雞球蟲對其不易產(chǎn)生耐藥性，有著廣闊的前景[3]。劉星等[4]用20種中草藥體外抑殺兔腸球蟲及肝球蟲卵囊，結(jié)果表明，側(cè)柏葉、白頭翁、大蒜、農(nóng)吉利、苦參、魚腥草、洋蔥、皂角和穿心蓮等藥物有較高的抑殺作用；李文超等[5]用白頭翁湯復(fù)方及組分抑殺柔嫩艾美耳球蟲卵囊，白頭翁及其總皂苷對球蟲卵囊的孢子化抑制效果較好。本研究用大蒜浸出液進行抗雞球蟲效果試驗，以期為大蒜浸出液抗雞球蟲在臨床應(yīng)用方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲株及動物

柔嫩艾美耳（E.tenella）蟲株由本教研室提供；1日齡蛋雞公雛購于南昌熊坊孵化場；干制蒜瓣購于農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 溶液的制備

飽和食鹽水、2.5%重鉻酸鉀液：稱取2 280 g食鹽和2.5 g重鉻酸鉀，分別加入6 000 mL開水和100 mL清水中，溶解過濾。

蒜瓣浸出液：稱取干制蒜瓣50 g加入100 mL清水，豆?jié){機打碎、過濾，取50、20、10 mL濾液，分別加50、80、90 mL蒸餾水，配制成50%、20%、10%的浸出液。

1.3 蟲株復(fù)壯、增殖

取E.tenella蟲株卵囊液，對水離心2遍洗去重鉻酸鉀液，經(jīng)口感染公雛，6 d后檢查糞便卵囊，當卵囊大量排出時，守候收集雛雞剛排出的新鮮糞便于盛有適量4 ℃冷水的500 mL燒杯中，4 ℃冰箱保存。

1.4 卵囊分離收集

糞便加4 ℃冷水拌勻，過濾，2 000 r/min離心5 min，傾上清液留沉淀，加4 ℃ 10 mL飽和食鹽水再2 000 r/min 離心5 min，留上清液棄沉淀物，加冷水離心，傾上清液留沉淀液，重復(fù)2～3遍。

1.5 試驗分組

試驗設(shè)體外抑殺未孢子化卵囊發(fā)育組（Ⅰ組）、體外抑殺未孢子化卵囊感染組（Ⅱ組）、體外抑殺孢子化卵囊感染組（Ⅲ組）、體內(nèi)阻斷球蟲發(fā)育組（Ⅳ組）、感染對照組（Ⅴ組）、空白對照組（Ⅵ組）。第Ⅰ組：卵囊分別投入50%、20%、10%的蒜瓣浸出液、2.5%重鉻酸鉀液中，每份3個重復(fù)，恒溫培養(yǎng)24、48、72 h后計算卵囊孢子化率。第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組，雛雞10日齡時隨機分組（6只/組），飼養(yǎng)于消毒后的不銹鋼籠內(nèi)，食用不含藥物或雞球蟲污染的飼料和水。25日齡時空腹稱重，第Ⅱ、Ⅲ組：分別以50%蒜瓣浸出液抑殺的未孢子化、孢子化卵囊，恒溫培養(yǎng)48 h后洗凈感染1×105個/只卵囊；第Ⅳ組：感染1×105個/只孢子化卵囊，以20%的蒜瓣浸出液作為驅(qū)蟲中藥替代飲水；第Ⅴ組：感染1×105個/只孢子化卵囊后不給藥；第Ⅵ組：不感染不給藥。分組后每天觀察雛雞的精神、飲食和糞便狀況，記錄發(fā)病雞或死亡雛雞數(shù)，對死亡雛雞解剖確定是否死于球蟲?。桓腥镜?天起，每天檢查收集Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組雛雞糞便，統(tǒng)計血便堆數(shù)，計算OPG；感染后第八天各組雛雞空腹稱重并剖檢，觀察雞只盲腸病變并給分。

1.6 卵囊的計算

1.6.1 卵囊孢子化率 卵囊培養(yǎng)24、48、72 h時，吸管取1滴于載玻片中央，加蓋玻片在顯微鏡下逐行隨機計算未孢子化卵囊及孢子化卵囊100以上個數(shù)，重復(fù)計數(shù)3次，分別記錄每次孢子化卵囊與未孢子化卵囊的數(shù)據(jù)。用Excel軟件統(tǒng)計每個樣品中孢子化卵囊平均百分率、標準差及t檢驗的差異水平。

1.6.2 卵囊定量感染 用刻度吸管移取孢子化卵囊液1 mL于青霉素空瓶內(nèi)，使10 μL卵囊液中卵囊數(shù)在40～100個為好。用10 μL移液器吸卵囊液于載玻片上，覆蓋玻片在160倍顯微鏡下逐行計數(shù)，以重復(fù)計數(shù)3次的平均值，推算稀釋后體積內(nèi)的卵囊總數(shù)，也就是1 mL原液內(nèi)的卵囊數(shù)。根據(jù)試驗攻蟲數(shù)（1×105個/只），確定卵囊原液體積。

1.7 抗球蟲效果判斷標準

根據(jù)各組相對增重率、血便記分、存活率、病變值、卵囊值與抗球蟲指數(shù)（ACI）綜合評價。

1.7.1 相對增重率 相對增重率=（感染各組雛雞平均增重/不感染不給藥組雞平均增重）×100%。endprint

1.7.2 血便記分 感染第5、6、7天參考 Morehouse[6]的方法，按以下標準記分：正常0分；少量血便1分；中等量血便2分；許多血便3分；無正常糞便4分。0分不作記錄次數(shù)計。平均糞便記分=每組雞糞便記分之和/記錄次數(shù)。

1.7.3 雞糞便OPG 參照斯陶爾氏法（Stolls method）[7]計算OPG。

1.7.4 存活率 存活率=（組內(nèi)雞存活數(shù)/組內(nèi)雞總數(shù)）×100%。

1.7.5 病變值 病變值=每組平均病變記分×10，病變記分按Johnson等[8]的方法給盲腸病變記分。摘取盲腸，盲腸兩側(cè)病變不一致時，以嚴重的一側(cè)為準。盲腸正常并且無肉眼病變，記0分；盲腸壁有很少量散在淤血點，但腸壁不增厚，內(nèi)容物正常記1分；盲腸壁增厚，盲腸內(nèi)容物明顯帶血，病變數(shù)量較多，記2分；盲腸內(nèi)容物多量帶血或有盲腸芯，盲腸壁肥厚明顯，記3分；盲腸因充滿大量血液或腸芯而明顯腫大，外觀呈醬色，記4分。死于球蟲病雞只記4分。

1.7.6 卵囊值 取感染后第5～7天雛雞糞便每克糞便中的卵囊數(shù)（OPG）的平均值與感染對照組雛雞OPG值的比值。并按角田清[9]標準，比值小于1%，卵囊值為0；在1%～25%時，卵囊值為5；在25%～50%時，卵囊值為10；在50%～75%時，卵囊值為20；在75%～100%時，卵囊值為40。

1.7.7 抗球蟲指數(shù) 按文獻[7]計算（ACI）：ACI=（存活率+相對增重率）-（病變值+卵囊值+血便計分）；判定標準：ACI≥180判為高效，160～179判為中效，120～159判為低效，<120判為無效。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒜瓣浸出液對E.tenella卵囊孢子化率的影響

由表1可知，E.tenellag球蟲卵囊隨蒜瓣浸出液濃度降低和時間的延長，孢子化率呈上升趨勢；50%、20%濃度蒜瓣浸出液于24、48、72 h與對照組差異均顯著（P<0.05），10%濃度蒜瓣浸出液于24、48、72 h與對照組差異均不顯著（表1）。

2.2 蒜瓣浸出液抗E.tenella球蟲效果

抗球蟲效果判斷標準是根據(jù)各組相對增重率、血便記分、存活率、病變值、卵囊值與抗球蟲指數(shù) （ACI）綜合評價（表2）。

2.2.1 臨床及剖解情況 空白對照組（第Ⅵ組）雛雞精神、食欲、糞便均正常。感染對照組（第Ⅴ組）及各試驗組的雛雞均有不同數(shù)量、不同程度表現(xiàn)精神沉郁、采食量減少或食欲廢絕、羽毛散亂、畏寒等癥狀，第5～7天，第Ⅲ、Ⅴ組部分雛雞出現(xiàn)血便。病變主要局限于盲腸，盲腸腫脹并有凝血塊及充滿干酪樣物質(zhì)，盲腸硬化并脆弱；盲腸明顯萎縮，其長度等于或短于直腸，內(nèi)容物少，整個盲腸 呈粉紅色。

2.2.2 增重與相對增重率 在第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組中，以第Ⅱ組雛雞的平均增重及相對增重率最高，組間差異不顯著，與感染對照組（第Ⅴ組）差異顯著。

2.2.3 卵囊比值與卵囊值 第Ⅲ組平均OPG數(shù)僅次于感染對照組（第Ⅴ組），遠高于Ⅱ、Ⅳ組，差異顯著；第Ⅱ、Ⅳ組卵囊比值在25%～50%區(qū)間，卵囊值均為10；第Ⅲ組卵囊比值在75%～100%區(qū)間，卵囊值為40。

2.2.4 血便、病變記分與病變值 第Ⅲ、Ⅴ組部分雞只出現(xiàn)血便；第Ⅲ組病變值（11.7）僅次于第Ⅴ組（23.3），第Ⅲ、Ⅳ組間差異顯著。

2.2.5 抗球蟲指數(shù)（ACI） 在第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ3組中，ACI以第Ⅱ組（173.95）為最高，第Ⅳ組次之，2組均判為中等效果。第Ⅲ組ACI為117.55，小于120判為無效。

3 小結(jié)與討論

3.1 蒜瓣浸出液對卵囊的影響

試驗以蒜瓣浸出液抑殺未孢子化卵囊，了解卵囊的孢子化率情況；通過蒜瓣浸出液抑殺未孢子化、孢子化卵囊后感染雛雞和直接感染卵囊后口服蒜瓣浸出液，與感染對照組、空白對照組比較，掌握蒜瓣浸出液的抗球蟲指數(shù)（ACI）。

3.1.1 體外影響 大蒜素是大蒜的主要活性成分，具有良好的藥用價值。大蒜素具有廣泛的藥理活性， 抗菌譜廣，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌都具有較好的抑制作用[10]。結(jié)果表明，蒜瓣浸出液也具有良好的抑殺柔嫩艾美耳球蟲未孢子化卵囊作用；抑殺未孢子化卵囊后感染雛雞，相對增重值較高、卵囊比值最低，抗球蟲指數(shù)（173.95）為中等效果；對孢子化卵囊抑殺效果不佳。

3.1.2 體內(nèi)影響 感染卵囊后口服20%的蒜瓣浸出液，作為一種中草藥驅(qū)蟲，卵囊比值最低，抗球蟲指數(shù)（161.90）為中等效果。但蒜瓣浸出液含有大蒜素，味辣，適口性極差，容易引起雞體缺水，影響采食和增重。降低蒜瓣浸出液濃度適當可以改善適口性、增重等，但是否造成抗球蟲指數(shù)下降而為低效或無效，有待進一步研究。

3.2 蟲株對ACI的影響

柔嫩艾美耳球蟲是雞的艾美耳球蟲中致病性最強的一種，它主要危害15～45日齡雛雞，本試驗感染對照組的結(jié)果表明：ACI值為91.7、血便情況不嚴重、沒有死亡雛雞，說明試驗使用的柔嫩艾美耳球蟲蟲株的毒力不夠強（試驗采用了經(jīng)多次復(fù)制傳代、早熟為多的蟲株，毒力不太強），還是選擇從野毒株中分離出的柔嫩艾美耳球蟲蟲株試驗為好。

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LIU Li-heng，LUO Feng，WU Jia-bin

（College of Animal Science and Technology， Jiangxi Agriculture University， Nanchang 330045，China）

Abstract： Five groups were set to investigate the clinical application of garlic lixivium in anti-E.tenella Coccidia. The oocysts in group I were put in 50%，20%，10% garlic lixivium with 2.5% potassium dichromate solution， and incubated in constant temperature for 24，48， and 72 hours to calculate sporulated oocysts. In group II and III， the un-sporulated oocysts and sporulated oocysts were incubated in constant temperature for 48 hours after killed by the 50% garlic lixivium， and then adopted 1×105 oocysts to infect chickens. In group IV，the chicken were infected with 1×105 sporulated oocysts and treated with 20% garlic lixivium instead of drinking water. In group V， the chicken were infected with 1×105 sporulated oocysts without any repellent or herbs. The group VI was control group with no infection and no repellent or herbs supplied. The results showed that the sporulated rate of oocysts treated with 50%， 20% garlic lixivium and incubated 24 h， 48 h， 72 h were significantly different from the control group（P<0.05）. The average weight gain of the chicken in group II were relatively higher and showed significant difference with group V（P<0.05）. The average OPG number of the chickens in group III were only lower than that of group V， and significantly higher than that of group II and IV. The oocysts ratio of group II and IV was from 25% to 50%， with the oocysts value of 10. The oocysts ration of group III was between 75% to 100%， with the oocysts value of 40. There only part of chickens in group III and IV were observed bloody stool with not seriousness. The lesions value of group III was 11.7， only lower than group V （23.3） and significantly different with group IV. The ACI number in group II was 173.95 and followed by group IV. Both two treatments were judged as moderate effect. The ACI of group III was 117.5， and judged as invalid effect with the number below 120. It is indicated that the garlic lixivium was benefit to in vitro inhibition of un-sporulated oocysts infection and intro restraining of coccidian growth.

Key words： Garlic clove； Anti-E.tenella； effectendprint