竹柳細胞壁綜纖維素和木質(zhì)素單體及含量研究

李強　姜山

摘要：運用超聲波輔助提取、DFRC（衍生化后的還原裂解）法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）對竹柳（Salix maizhokunggarensis N. Chao）細胞壁綜纖維素和木質(zhì)素單體進行了測定；采用差重法和Kalson法結(jié)合紫外分光光度法測定了竹柳細胞壁綜纖維素和木質(zhì)素含量。結(jié)果表明，竹柳細胞壁綜纖維素單體包括D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-巖藻糖和D-纖維二糖，木質(zhì)素主要由愈創(chuàng)木基（G）和紫丁香基（S）組成。竹柳細胞壁綜纖維素含量為80.16%，木質(zhì)素含量為19.84%。

關(guān)鍵詞：竹柳（Salix maizhokunggarensis N. Chao）；綜纖維素；木質(zhì)素；衍生化后的還原裂解（DFRC）法

中圖分類號：S781.42 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）01-0097-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.01.025

植物細胞壁主要由綜纖維素、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)組成，作為植物光合作用產(chǎn)物的主要貯積方式，構(gòu)成了地球植物生物量的主要組成部分。纖維素是無水葡萄糖以β-1，4糖苷鍵組成的長鏈分子，半纖維素是戊糖、己糖和糖酸所組成的不均一聚糖[1]，木質(zhì)素是由苯丙氨酸經(jīng)脫氨莖、羥基化、甲基化和氧化還原反應(yīng)，生成3種主要單體香豆醇、松柏醇和芥子醇，這些單體經(jīng)氧化偶聯(lián)聚合生成相應(yīng)的3種木質(zhì)素：對羥基苯基木質(zhì)素（H）、愈創(chuàng)木基木質(zhì)素（G）和紫丁香基木質(zhì)素（S）[2]。綜纖維素和木質(zhì)素是組成木材的主要成分，它們的組成及含量與木材的性質(zhì)以及木材的加工利用密切相關(guān)[3]。一般情況下，纖維素含量越高，則制漿率越高；而木質(zhì)素交聯(lián)在纖維素和半纖維之間形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是木材造紙的一大難題，木質(zhì)素含量越低，制漿漂白越容易，消耗的化學(xué)藥品越少[4，5]。通過基因工程方法調(diào)控木質(zhì)素含量和組成類型，優(yōu)化植物光合作用所生產(chǎn)的生物量在綜纖維素和木質(zhì)素之間的分配對木材的制漿性能有很大的潛在價值[6]。測定細胞壁中綜纖維素和木質(zhì)素單體成分及含量無疑為提升木材工業(yè)化應(yīng)用提供了重要參考依據(jù)。

竹柳（Salix maizhokunggarensis N. Chao）為楊柳科（Salicaceae）柳屬（Salix）落葉喬木，是經(jīng)選優(yōu)選育出的一個柳樹品種，由于其同時具有染色體加倍實現(xiàn)的倍性優(yōu)勢和雜種優(yōu)勢，故不僅具備柳樹所有優(yōu)良特性，且具有生長速度快、抗逆性強、材質(zhì)好等特點，因此作為工業(yè)原料林具有一定優(yōu)勢[7]。以往對于竹柳的研究主要集中在纖維質(zhì)量及制漿性能方面，對于其細胞壁中綜纖維素和木質(zhì)素的單體成分及含量報道非常少。為此，采用超聲波輔助提取、衍生化后的還原裂解（DFRC）法結(jié)合GC-MS分析了竹柳細胞壁綜纖維素和木質(zhì)素單體成分，同時還采用差重法和Kalson法結(jié)合紫外分光光度法測定了綜纖維素和木質(zhì)素含量對DFRC法結(jié)果加以驗證，以期為更好地開發(fā)利用竹柳奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為取自貴州省黔南地區(qū)的一年生竹柳。

儀器：QP2010c型氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Shimadzu公司，數(shù)據(jù)庫為NIST27、NIST147）；LX-02多功能粉碎機；101A-3型電熱鼓風干燥箱；HHS型電熱恒溫水浴鍋；分析天平（十萬分之一，梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；N-1001型EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；精密酸度計（上海大普儀器有限公司）。

試劑：乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、丙酮、乙酸、溴乙酰、二氧六環(huán)、鋅粉、膽固醇，均為市售分析純。

1.2 細胞壁樣品提取

樣品粉碎后，過60～80目篩，然后每克樣品加40 mL體積分數(shù)80%的乙醇超聲處理10 min，4 000 r/min離心5 min，去上清，重復(fù)4次，再依次用氯仿/甲醇（2∶1，V∶V）和丙酮抽提1次，空氣風干[8]。

1.3 DFRC法分析細胞壁樣品

1.3.1 溴乙酰衍生和細胞壁溶解反應(yīng) 準確稱量50 mg（W1）細胞壁樣品加到50 mL具塞三角瓶中，加入10 mL新鮮配制的溴乙酰溶液（溴乙?！靡掖?1∶4，V/V），蓋上玻璃塞于50 ℃輕輕攪拌3 h，然后在50 ℃以下負壓蒸干[9]。

1.3.2 還原斷裂反應(yīng) 向具塞三角瓶中加入10 mL二氧六環(huán)/乙酸/水（5∶4∶1，V/V/V），再加入200 mg（W2）鋅粉，常溫攪拌30 min，然后用砂芯漏斗過濾，濾渣于60 ℃烘至恒重（W3），濾液全部轉(zhuǎn)入預(yù)先備有15 mL二氯甲烷和15 mL飽和氯化銨的分液漏斗中，加入200 μL內(nèi)標（80 mg膽固醇溶解于2 mL二氯甲烷），水相用3%的鹽酸調(diào)到pH 3以下，充分混勻，靜置分層并收集下部二氯甲烷相。另外用15 mL二氯甲烷萃取飽和氯化銨相，重復(fù)2次，合并二氯甲烷相，低壓旋轉(zhuǎn)蒸干，乙?；笊螱C-MS分析[10]。

1.3.3 計算反應(yīng)率 反應(yīng)率=■ （1）

1.4 竹柳細胞壁綜纖維素含量測定

稱取約1.5 g細胞壁樣品，于60 ℃烘至恒重W4，再轉(zhuǎn)入250 mL碘量瓶中，加入150 mL 2 mol/L的HCl，105 ℃保溫50 min，然后用去離子水沖洗過濾至濾液pH 6.5～7.0，接下來依次用體積分數(shù)95%的乙醇、無水乙醇、丙酮各洗滌2次，殘渣轉(zhuǎn)入已恒重的坩堝（W5）中，于60 ℃干燥箱中烘至恒重（W6）。將殘渣轉(zhuǎn)入150 mL燒杯中，加入15 mL預(yù)冷過的72%的硫酸水解3 h，然后加去離子水135 mL，室溫過夜，殘渣次日用去離子水沖洗過濾至濾液pH 6.5～7.0，濾渣轉(zhuǎn)入已恒重的坩堝（W7）中，于60 ℃干燥箱中烘至恒重（W8）。按公式（2）、（3）、（4）計算半纖維素、纖維素和綜纖維素含量，平行測定樣品6份，取平均值[11，12]。endprint

半纖維素含量=■×100% （2）

纖維素含量=■×100% （3）

綜纖維素含量=半纖維素含量+纖維素含量（4）

1.5 竹柳細胞壁木質(zhì)素含量測定

準確稱量1 g（W9）細胞壁樣品，加72%的硫酸15 mL，室溫攪拌4 h，轉(zhuǎn)入1 000 mL圓底燒瓶中，加560 mL去離子水稀釋硫酸濃度至3%，加熱回流2 h，再用砂芯漏斗過濾，收集濾液，殘渣用熱水洗滌至中性，轉(zhuǎn)入已恒重的坩堝（W10）于105 ℃烘干至恒重，稱量（W11）并按公式（5）計算酸不溶木質(zhì)素含量，平行測定樣品6份，取平均值[12，13]。

酸不溶木質(zhì)素含量=■×100% （5）

濾液在205 nm波長下測吸光度，如果吸光度大于0.7，則用3%的硫酸溶液稀釋，當吸光度為0.2～0.7，按公式（6）和公式（7）計算，平行測定樣品6份，取平均值。

B=■×D （6）

酸溶木質(zhì)素含量=■×100% （7）

式中，B為濾液中酸溶木質(zhì)素的含量（g/1 000 mL）；A為吸光度；D為樣品濾液的稀釋倍數(shù)；V為濾液總體積；110為吸光系數(shù)[L/（g·cm）]。

木質(zhì)素含量=酸不溶木質(zhì)素含量+酸溶木質(zhì)素含量 （8）

2 結(jié)果與分析

2.1 DFRC法分析細胞壁成分

衍生化后的還原裂解（DFRC）法包括兩個重要步驟：①細胞壁在溴乙酰和乙酸混合溶液中溶解，②鋅粉催化還原裂解，在溴乙酰中植物細胞壁被溶解，酸性環(huán)境下細胞壁多糖進一步水解[14，15]，結(jié)合GC-MS通過查找數(shù)據(jù)庫可以確定樣品DFRC法獲得的化合物組成，進一步解析樣品細胞壁成分。通過計算反應(yīng)率得出，大于95%的竹柳細胞壁參加了反應(yīng)，所以試驗中DFRC法產(chǎn)物包含了竹柳細胞壁的主要物質(zhì)組成。

表1是竹柳細胞壁DFRC降解物氣相色譜檢測到的主要化合物保留時間、名稱以及含量，除9和10是內(nèi)標膽固醇及其乙?；a(chǎn)物外，1～8是竹柳細胞壁DFRC法檢測到的主要產(chǎn)物：D-木糖乙酸酯、L-阿拉伯糖乙酸酯、D-半乳糖乙酸酯、愈創(chuàng)木基乙酸酯、D-葡萄糖乙酸酯、紫丁香基乙酸酯、L-巖藻糖乙酸酯和D-纖維二糖乙酸酯。根據(jù)構(gòu)成綜纖維素和木質(zhì)素的單體類型可知，竹柳細胞壁綜纖維素單體主要是D-木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-巖藻糖和D-纖維二糖，木質(zhì)素的單體主要是G型和S型，沒有檢測到H型單體。不計算內(nèi)標的情況下，綜纖維素和木質(zhì)素的含量分別為80.16%和19.84%。

2.2 竹柳細胞壁綜纖維素和木質(zhì)素含量分析

半纖維素是戊糖、己糖和糖酸所組成的不均一聚糖，易水解，高溫下經(jīng)稀酸處理幾乎可以把半纖維素全部水解成可溶性糖；纖維素是β-1，4糖苷鍵組成的長鏈分子，長鏈分子進一步形成一種具有高度結(jié)晶區(qū)的超分子穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以被濃酸溶解，在溶解過程中導(dǎo)致纖維素的均相水解[1]，因此依次用鹽酸、硫酸水解竹柳，準確稱量水解前后的重量并計算差重可以得出半纖維素、纖維素以及綜纖維素含量。采用Klason法和紫外分光法分別測定酸不溶木質(zhì)素和酸溶木質(zhì)素含量，試驗沒有檢測植物含有的少量礦質(zhì)元素，結(jié)果見表2。從表2可知，綜纖維素含量為79.03%，木質(zhì)素含量為20.35%，對比DFRC法測定的糖類和木質(zhì)素類含量，可以得出兩種方法測得的結(jié)果基本一致，說明DFRC法檢測出的竹柳細胞壁各成分含量可靠。

3 小結(jié)

竹柳細胞壁綜纖維素單體主要包括D-木糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-巖藻糖和D-纖維二糖，木質(zhì)素單體主要為G型和S型。據(jù)文獻報道，硬木H型木質(zhì)素單體含量一般很少甚至沒有，Lu等[9，14]在同是柳屬的柳樹中檢測到的H型木質(zhì)素單體含量相對于G型和S型也非常低（<1%），而試驗在竹柳細胞壁中沒有檢測到明顯的H型木質(zhì)素單體，原因有可能是竹柳細胞壁中H型木質(zhì)素單體的含量過低，或是沒有H型木質(zhì)素單體的存在，這需要進一步的試驗論證。同時還測得綜纖維素含量為80.16%，木質(zhì)素含量為19.84%。試驗中采用的DFRC法是美國威斯康星州牧草研究中心建立的用于解析細胞壁結(jié)構(gòu)的新方法，具有對試驗條件要求不高、操作流程簡潔和結(jié)果可靠等優(yōu)點，目前國內(nèi)鮮有將該方法運用于硬木細胞壁的研究。利用該方法對竹柳細胞壁綜纖維素和木質(zhì)素單體及含量的研究，將為竹柳在工業(yè)木材應(yīng)用中的深入發(fā)展奠定一定的基礎(chǔ)，還可為其他工業(yè)木材的定性定量分析提供借鑒。

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