煙草青枯菌拮抗放線菌和細(xì)菌的田間試驗(yàn)

陸錚錚　蔣選利

摘要：從健康煙草根圍土壤中分離、篩選得到對(duì)煙草青枯病菌拮抗效果較好的放線菌和細(xì)菌。經(jīng)鑒定兩株拮抗放線菌均屬鏈霉菌屬（Streptomyces），分別是綠色類(lèi)群橄欖綠鏈霉菌（S. olivaceoviridis）、粉紅孢類(lèi)群玫瑰暗黃鏈霉菌（S. roseofulvus）；拮抗細(xì)菌分別為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericu）。在貴州省麻江縣煙田進(jìn)行田間試驗(yàn)，3次平均相對(duì)防效從大到小依次為粉紅孢類(lèi)群玫瑰暗黃鏈霉菌（63.65%）、球形賴氨酸芽孢桿菌（60.03%）、蠟樣芽孢桿菌（43.85%）、綠色類(lèi)群橄欖綠鏈霉菌（41.76%）、40%硫酸鏈霉素（17.11%）。

關(guān)鍵詞：煙草青枯??；放線菌；細(xì)菌；田間試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.72 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）01-0087-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.01.022

由青枯勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum E.F.Smith）引起的煙草青枯病，又稱煙瘟、“半邊瘋”，素有植物“癌癥”之稱[1]。該病菌可以侵染50多個(gè)科的200多種植物[2]，傳播速度快，存活時(shí)間長(zhǎng)[3]，造成的危害嚴(yán)重，給許多農(nóng)作物帶來(lái)了巨大的傷害。目前對(duì)煙草青枯病的防治尚未有理想的藥劑，且抗病品種的應(yīng)用也常受到自然條件的限制和抗性喪失等問(wèn)題的困擾[4]。Cook等[5]和Chef[6]通過(guò)向土壤施加拮抗微生物來(lái)防治土傳病害，并取得了一定的防治效果。研究者認(rèn)為生物防治在未來(lái)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要地位。

前期研究分離了煙草根圍土壤中的微生物，通過(guò)平板對(duì)峙法篩選出了2株拮抗放線菌（平均抑菌圈直徑分別為43.20 mm、54.66 mm）和2株拮抗細(xì)菌（平均抑菌圈直徑分別為39.98 mm、48.88 mm）。2011年4月，選擇在貴州麻江杏山鎮(zhèn)麒麟村煙田中進(jìn)行田間效果試驗(yàn)，通過(guò)采用浸根、灌根的處理方法和3次病害調(diào)查的平均結(jié)果對(duì)田間效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試放線菌和細(xì)菌 選擇抑制效果最好的2株放線菌，分別為綠色類(lèi)群橄欖綠鏈霉菌（Streptomyces olivaceoviridis，編號(hào)為F4-3）、粉紅孢類(lèi)群玫瑰暗黃鏈霉菌（S. roseofulvus，編號(hào)為F6-3），用燕麥液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，制成放線菌懸浮液。選擇抑制效果最好的2株細(xì)菌，分別為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，編號(hào)為C3-5）、球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericu，編號(hào)為C5-3），用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，制成細(xì)菌懸浮液。

1.1.2 培養(yǎng)基[7] 液體燕麥培養(yǎng)基：燕麥片 30 g、水 1 000 mL；固體燕麥培養(yǎng)基：在液體燕麥培養(yǎng)基中加瓊脂 20～25 g；液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏 3～5 g、蛋白胨 10 g、NaCl 5 g、蒸餾水 1 000 mL；固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：在液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加瓊脂 20～25 g。

1.1.3 試區(qū)概況及供試品種 試驗(yàn)在麻江縣杏山鎮(zhèn)麒麟村煙田中進(jìn)行，海拔930 m，常年連作煙草，煙草青枯病發(fā)生嚴(yán)重，供試煙草品種為南江3號(hào)（中感青枯?。?。

1.2 方法

1.2.1 供試菌液制備方法 用滅菌竹簽挑取放線菌在固體燕麥培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，用直徑為5 mm的打孔器打取放線菌的菌碟，取5個(gè)菌碟置于裝有300 mL液體燕麥培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于28 ℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)4 d可獲得放線菌懸浮液。

用接種環(huán)挑取細(xì)菌于5 mL的無(wú)菌水中，混勻。用移液槍吸取0.1 mL菌液分散地放于NA平板上，用無(wú)菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，約20 min后，倒置于32 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d后，用直徑為5 mm的打孔器打取細(xì)菌的菌碟，取5個(gè)菌碟置于裝有300 mL NA液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于32 ℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)4 d后即可獲得細(xì)菌懸浮液。

1.2.2 田間設(shè)置 試驗(yàn)共設(shè)6個(gè)處理，處理一：含F(xiàn)4-3；處理二：含F(xiàn)6-3；處理三：含C3-5；處理四：含C5-3；處理五：40%硫酸鏈霉素（2 000倍稀釋液，藥劑對(duì)照）；處理六：清水（空白對(duì)照）。每處理3個(gè)重復(fù)，共計(jì)18個(gè)小區(qū)，隨機(jī)區(qū)組排列。每小區(qū)種有煙株82穴，每個(gè)小區(qū)之間和田邊都留出一行做為保護(hù)行。

2011年4月30日移栽煙苗，移栽前先用拮抗放線菌或細(xì)菌的液體培養(yǎng)液浸根40 min后再移栽，移栽完畢后，每株煙苗再用生防菌懸浮液40 mL+清水160 mL混合液澆根。之后每隔20 d澆灌1次，每株煙苗使用40 mL生防菌懸浮液澆灌，整個(gè)煙株生長(zhǎng)期共澆灌3次。藥劑對(duì)照和空白對(duì)照的浸根、灌根時(shí)間、次數(shù)相同。于2011年6月30日處理完畢。

1.2.3 田間病害調(diào)查 以整株為單位，于2011年6月20日進(jìn)行第一次調(diào)查，整個(gè)試驗(yàn)階段共調(diào)查3次，間隔時(shí)間10 d。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)全國(guó)煙草行業(yè)煙草病害調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)YC/T39-1996進(jìn)行[8]。0級(jí)：全株無(wú)??；1級(jí)：莖部偶有退綠條斑，或（和）半數(shù)以下葉片或頂葉輕度凋萎；2級(jí)：莖部有明顯黑色條斑但尚未達(dá)到植株頂部，或（和）病側(cè)半數(shù)以上葉片或部分腰葉以上葉片凋萎；3級(jí)：莖部黑色條斑達(dá)到植株頂部，或病側(cè)葉片全部凋萎，或全株大部分葉片凋萎；4級(jí)：病株枯死。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析方法[9]

發(fā)病率=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%

病情指數(shù)=∑（各級(jí)病株或葉數(shù)×該病級(jí)值）/（調(diào)查總株或葉數(shù)×最高級(jí)值）×100endprint

相對(duì)防效=（對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對(duì)照區(qū)病情指數(shù)×100%

采用Excel軟件計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)、相對(duì)防效；DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析平均相對(duì)防效之間的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌、細(xì)菌田間試驗(yàn)結(jié)果

第一次調(diào)查的時(shí)間為煙苗移栽后的50 d，之后每隔10 d調(diào)查一次，共調(diào)查3次。將這3次對(duì)煙草青枯病害調(diào)查的數(shù)據(jù)單獨(dú)統(tǒng)計(jì)，計(jì)算出3個(gè)重復(fù)小區(qū)的平均發(fā)病率、病情指數(shù)和相對(duì)防效。不同處理對(duì)煙草青枯病菌的防治效果見(jiàn)表1。由表1可知，①?gòu)?株放線菌的防治效果上看，與清水以及處理五相比，都表現(xiàn)為不同程度的防治作用。3次調(diào)查的結(jié)果都表明處理二的發(fā)病率始終是最低、病情指數(shù)最小、相對(duì)防效是最好的。②從2株細(xì)菌的防治效果上看，與清水以及處理五相比，也都表現(xiàn)為不同程度的防治作用。同樣3次調(diào)查的結(jié)果都表明處理四的發(fā)病率始終是最低、病情指數(shù)最小、相對(duì)防效是最好的。③從2株拮抗放線菌與2株拮抗細(xì)菌的防效對(duì)比上看，處理二的效果最好。則3次調(diào)查的相對(duì)防效平均值由大到小依次為處理二（63.65%）、處理四（60.03%）、處理三（43.85%）、處理一（41.76%）、處理五（17.11%）。④從處理五與清水處理對(duì)比上看，施用處理五的煙株，對(duì)煙草青枯病的防治略微有效，但是防效不明顯。⑤從不經(jīng)過(guò)任何處理的對(duì)照組的數(shù)據(jù)上分析，其發(fā)病率隨時(shí)間推移越來(lái)越大，到了后期高達(dá)63.38%，這說(shuō)明了該地塊的煙草青枯病發(fā)病非常的嚴(yán)重，損失相當(dāng)?shù)拇蟆?/p>

2.2 相對(duì)防效的差異顯著性分析

由表2可知，試驗(yàn)的4株生防菌中對(duì)煙草青枯病的防效與處理五相比均有極顯著差異。處理二與處理四3次調(diào)查表明沒(méi)有顯著或極顯著差異，但處理二的防效略高于處理四；處理一在第一次調(diào)查時(shí)防效極顯著高于處理三，但是另外兩次調(diào)查防效均沒(méi)有顯著差異。由此可知，防治效果由高到低依次是處理二 、處理四 、處理三、處理一、處理五。

綜上所述，2株拮抗放線菌和2株拮抗細(xì)菌的田間防治效果由大到小依次為F6-3、C5-3、C3-5、 F4-3。

3 小結(jié)與討論

1）采用平板對(duì)峙法篩選出的2株拮抗放線菌和2株拮抗細(xì)菌，不僅平板上的抑制效果明顯，且田間中的防治效果也顯著。其相對(duì)防效均明顯好于硫酸鏈霉素，且效果較穩(wěn)定。由此可見(jiàn)，煙草根圍土壤中的拮抗放線菌和拮抗細(xì)菌能夠較好地與病原菌競(jìng)爭(zhēng)，從而達(dá)到防治病害發(fā)生的作用。特別是土壤中的鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬的菌株。

2）田間試驗(yàn)效果表明，粉紅孢類(lèi)群玫瑰暗黃鏈霉菌（S. roseofulvus，編號(hào)為F6-3）的防效最好。2株拮抗細(xì)菌也表現(xiàn)出較好的防治效果，且細(xì)菌的繁殖速度快，培養(yǎng)周期短。

3）本研究是對(duì)拮抗菌懸浮液的原液進(jìn)行了田間測(cè)定，還需在不同的濃度梯度上進(jìn)行試驗(yàn)，進(jìn)一步篩選出最佳的濃度，為提高這4種生防菌的利用價(jià)值提供出參考。

參考文獻(xiàn)：

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