格列苯脲有關(guān)物質(zhì)檢查中色譜柱的選擇

孫 義，周學(xué)輝，王志英，曾玉香

（天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300402）

高效液相色譜法（HPLC）具有選擇性高、分離效率高、靈敏度高、分析速度快等特點，應(yīng)用越來越廣泛。目前，各國藥品標(biāo)準(zhǔn)越來越多地使用高效液相色譜法作為含量測定和有關(guān)雜質(zhì)檢查的方法［1］。高效液相色譜法的核心是起分離作用的色譜柱，色譜柱的種類很多，其中以硅膠為基質(zhì)的反相色譜柱尤其是C18柱應(yīng)用最為廣泛。齊宗韶［2］介紹了色譜法在《中華人民共和國藥典（2005年版）》（簡稱《中國藥典》）一部、二部中的應(yīng)用，指出HPLC法主要選用C18柱（反相色譜柱）。對比中國、美國、英國、日本等國和歐盟藥典中對HPLC方法的描述，發(fā)現(xiàn)給出的色譜柱信息通常比較簡單。以格列苯脲的測定為例，《中國藥典》對色譜柱只規(guī)定“用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑”，信息非常簡單。藥品標(biāo)準(zhǔn)起著監(jiān)控藥品質(zhì)量的作用，HPLC法作為含量測定方法和有關(guān)雜質(zhì)檢查的方法，更應(yīng)確保方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性［3］。目前市場上有600多種C18色譜柱［4］，且不斷有新的色譜柱出現(xiàn)。采用不同色譜柱分析具體樣品時，由于色譜柱選擇性的差異，溶質(zhì)的保留值、色譜峰之間的分離度等都可能出現(xiàn)較大的差異［5－6］，導(dǎo)致藥典執(zhí)行過程中很難保證檢查方法的重現(xiàn)性。以格列苯脲的測定為例，李莉等［7］在HPLC法測定保健食品及中藥制劑中化學(xué)降糖藥的含量時采用Zorbax SB－C18柱（250mm×4.16mm，5μm）測定，格列苯脲的保留時間為15.134min。黃作君等［8］在高效液相色譜法測定人血漿中格列苯脲濃度時采用Nova－pak C18柱（4.6mm×250mm，4μm）進行測定，格列苯脲保留時間為14.600min。劉淑花等［9］在高效液相色譜法測定消渴平膠囊中格列苯脲含量時采用Kromasil C18柱（200mm×4.6mm，5μm）測定，格列苯脲的保留時間為14.148min。朱俐等［10］在HPLC快速檢測藥品及其在降糖類藥品中的應(yīng)用時采用Inertsil ODS－SP（4.6mm×150 mm，5μm）色譜柱，格列苯脲保留時間為7.000 min。可見在測定條件近似的情況下，采用不同的色譜柱，所獲得的結(jié)果是不同的，這對于實驗室之間數(shù)據(jù)的比較和交換很不利。此外，在重復(fù)某一藥物特定的HPLC方法時，有時無法獲得方法中所用的色譜柱，這就需要尋求同類型的色譜柱，即選擇性一致的色譜柱。在實際工作中也已經(jīng)證明選擇相同類型的色譜柱有利于不同實驗室間的數(shù)據(jù)交換［11］。如何進行色譜柱的選擇呢？本文以降糖藥格列苯脲為例，參照歐洲藥典（EP7.0）測試了幾種不同的色譜柱，比較了不同分類方法對色譜柱選擇的作用，對色譜柱的選擇提供參考，為格列苯脲的有關(guān)物質(zhì)檢查提供依據(jù)，為格列苯脲的分析檢測打好基礎(chǔ)。

格列苯脲為磺酰脲類口服降血糖藥物，有強大的降血糖作用，對大多數(shù)Ⅱ型糖尿病患者有效，可降低空腹及餐后血糖，糖化血紅蛋白。使用格列苯脲雖易致低血糖，但由于其價格低廉，臨床上仍在廣泛應(yīng)用。按照歐洲藥典（EP7.0），格列苯脲有關(guān)物質(zhì)的檢查采用高效液相色譜法（HPLC）。EP7.0規(guī)定，色譜柱柱長為0.10m，柱徑為4.6mm，BDS柱。色譜柱種類眾多，從數(shù)目如此多的色譜柱中選出可行的色譜柱顯然是比較困難的。如果有一定的方法可以選出分離效果相同的色譜柱，那么色譜柱的選擇就會簡單。王明娟等［12］和張偉清等［13］都提到了對色譜柱進行分類是解決色譜柱選擇的方法。

一些學(xué)者經(jīng)過大量實驗，得到了158根不同型號色譜柱的參數(shù)，并依據(jù)色譜柱的發(fā)展簡史將硅膠色譜柱分為3大類:A型色譜柱（即舊型色譜柱，old－type columns），B型色譜柱（即新型色譜柱，new－type columns）和E型色譜柱（即內(nèi)嵌極性基團或極性基團封尾的色譜柱，embeddedpolar－group columns，EPG）［14－16］。DORA等［17－18］依據(jù)經(jīng)驗法的考察結(jié)果也將硅膠基質(zhì)色譜柱分為3大類:Ⅰ類（主類，數(shù)目最多），Ⅱ類（硅羥基活性較高）和Ⅲ類，其中Ⅰ類分為Ⅰ－a類和Ⅰ－b類。Ⅰ－a類色譜柱多數(shù)屬于B型色譜柱，Ⅰ－b類色譜柱包括部分A型色譜柱、孔徑大于120?的B型色譜柱及整體柱等。此類分析結(jié)果與JONATHAN等［14］依據(jù)色譜柱發(fā)展簡史得到的分類結(jié)果接近。

本文選取Venusil ASB C18，Venusil MP C18，Venusil XBP C18，Venusil XBP－C18（L），Venusil XBP－C18（2）共5種色譜柱，對其進行分類并按照EP7.0方法進行系統(tǒng)適應(yīng)性測試。所選取的Venusil ASB C18，Venusil MP C18，Venusil XBP C18，Venusil XBP－C18（L），Venusil XBP－C18（2）柱，按照J(rèn)ONATHAN等的分類方法屬于B型柱［19］，按照DORA等對硅膠基質(zhì)色譜柱的分類方法，Venusil MP C18，Venusil XBP－C18（2），Venusil XBP C18屬于Ⅰ－a類柱；Venusil ASB C18，Venusil XBP－C18（L）屬于Ⅰ－b類柱。JONATHAN等［14］和WILSON等［16］的研究結(jié)果表明，B型色譜柱差異較小，絕大多數(shù)B型色譜柱存在等同色譜柱。所選色譜柱都屬于B型色譜柱，其分離性能應(yīng)接近［18］。但是這種分類方法還不能說明哪一種色譜柱更接近EP7.0方法所需的色譜柱。EP7.0參考色譜柱為Hypersil C18BDS（4.6mm×100mm，3μm）。按照J(rèn)ONATHAN等［14］分類方法，Hypersil C18BDS屬于A類柱；按照DORA等［18］對硅膠基質(zhì)色譜柱的分類方法，Hypersil C18BDS屬于Ⅰ－b類柱。按照DORA等［18］的分類方法，Venusil ASB C18，Venusil XBPC18（L）與EP7.0參考色譜柱Hypersil C18BDS屬于同一類型色譜柱，故按照分類方法推斷其測試結(jié)果應(yīng)更接近。

1 主要試劑與儀器

主要試劑:格列苯脲片（規(guī)格為2.5mg），山西云鵬制藥有限公司提供；格列齊特，山東某藥廠提供。

主要儀器:Agilent 1260HPLC。

2 色譜條件

流動相:梯度洗脫。流動相A:緩沖液（101.8 g/L的三乙胺溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0）－乙腈－水（體積比為20∶50∶930）；流動相B:流動相A－水－乙腈（體積比為20∶65∶915）；檢測波長:230 nm；柱溫:35℃；流速:0.8mL/min；進樣量:10μL。檢測結(jié)果見表1。

表1 檢測結(jié)果Tab.1 Test result

3 樣品配制

3.1 系統(tǒng)適用性試驗溶液的配制

取格列齊特5mg，置于100mL容量瓶中，加供試品溶液2mL，用甲醇定容至刻度。取1mL該溶液，用甲醇稀釋至10mL，即得。

3.2 供試品溶液的配制

取格列苯脲片10片，置于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲10min，過濾，即得。

4 供測試的色譜柱參數(shù)

ASB C18（4.6mm×150mm，3μm），MP C18（4.6mm×150mm，3μm），XBP C18（4.6mm×150 mm，3μm），XBP－C18（2）（4.6mm×150mm，3 μm），XBP－C18（L）（4.6mm×150mm，3μm）。

5 結(jié)果與討論

5.1 結(jié)果

測試5種色譜柱的試驗結(jié)果見表2。測試色譜圖以ASB C18柱為例，見圖1。

表2 5種色譜柱有關(guān)物質(zhì)檢查系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果Tab.2 System suitability test result of five columns on related substances

圖1 格列苯脲有關(guān)物質(zhì)檢查系統(tǒng)適用性試驗色譜圖（ASB C18柱）Fig.1 Chromatogram of the test for system suitability on related substences of glibenclamide using ASB C18 column

5.2 討論

歐洲藥典系統(tǒng)適用性試驗中要求格列苯脲與格列齊特峰之間的分離度大于5.0。通過表1的數(shù)據(jù)可以看出，5種色譜柱均能滿足歐洲藥典系統(tǒng)適用性試驗的要求。歐洲藥典提供的格列苯脲的保留時間為5min，其中ASB C18，XBP－C18（L）的保留時間與其接近（歐洲藥典采用的是10cm長的色譜柱，供測試的是15cm的色譜柱），而其他色譜柱保留時間則相差較大。

按照J(rèn)ONATHAN等［14］分類方法，幾款色譜柱均屬于B型色譜柱，分析結(jié)果證明分離都達到要求，但是按照J(rèn)ONATHAN等分類方法沒有能夠說明哪一款色譜柱與EP參考色譜柱Hypersil C18BDS測試結(jié)果更接近。按照DORA等［18］對硅膠基質(zhì)色譜柱的分類方法，Venusil ASB C18，Venusil XBP－C18（L）與EP參考色譜柱Hypersil C18BDS屬于同一類型色譜柱，經(jīng)過對格列苯脲進行系統(tǒng)適應(yīng)性試驗，驗證了其結(jié)果確實最為接近，這2種色譜柱測定供試品溶液的色譜圖分別見圖2和圖3?？梢钥闯?，這2種色譜柱與EP的要求非常接近，能夠滿足供試品的分離要求，以供后續(xù)的檢查。

圖2 格列苯脲有關(guān)物質(zhì)檢查供試品溶液色譜圖（XBP－C18（L）柱）Fig.2 Chromatogram of the test solution in separating glibenclamide from related substences using XBPC18（L）column

圖3 格列苯脲有關(guān)物質(zhì)檢查供試品溶液色譜圖（ASB C18柱）Fig.3 Chromatogram of the test solution in separating glibenclamide from related substences using ASB C18column

6 結(jié) 論

本試驗證明了色譜柱分類確實能夠?qū)嶋H樣品測定中色譜柱的選擇提供參考，可以提高分析時色譜柱的選擇效率，節(jié)約選擇色譜柱的時間。如果已知實驗室中色譜柱的類型，應(yīng)用現(xiàn)有色譜柱完成分析還可以節(jié)約資金，而且選擇相同類型的色譜柱有利于不同實驗室的數(shù)據(jù)交換。本實驗也說明不同的色譜柱選擇方法有所區(qū)別。以本實驗為例，可以將2種色譜柱分類方法相結(jié)合，由于B型色譜柱差異較小，絕大多數(shù)B型色譜柱存在等同色譜柱，所以首先按照J(rèn)ONATHAN等［14］分類方法選出類型相同的色譜柱即本實驗選出B型色譜柱，然后再利用DORA等［18］對硅膠基質(zhì)色譜柱的分類方法，進一步對色譜柱進行分類，從而得到所需色譜柱。在今后的研究中，還應(yīng)針對色譜柱的選擇研究，探尋更加準(zhǔn)確快速地找到滿足實驗要求的色譜柱的方法。

［1］ 李志偉，霍云霞，劉佳，等.HPLC法測定6－甲基尿嘧啶的含量及有關(guān)物質(zhì)［J］.河北工業(yè)科技，2010，27（1）:32－35.

LI Zhiwei，HUO Yunxia，LIU Jia，et al.Determination of 6－methyluralil content and related substange in HPLC［J］.Hebei Journal of Industrial Science and Technology，2010，27（1）:32－35.

［2］ 齊宗韶.色譜法在中國藥典（2005年版）一部、二部中的應(yīng)用［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2007，8（1）:69－72.

QI Zongshao.The application of chromatography in Ch.P.（2005）vol.1and vol.2［J］.Drug Standards of China，2007，8（1）:69－72.

［3］ 劉麗芳.藥品標(biāo)準(zhǔn)中HPLC法色譜條件的優(yōu)化與系統(tǒng)適用性試驗的重要性［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2005，6（1）:3－6.

LIU Lifang.The optimum chromatogram conditions of HPLC and the importance of system suitability method in pharmaceutical standard［J］.Drug Standards of China，2005，6（1）:3－6.

［4］ 王明娟，李婭萍，胡昌勤.藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中色譜柱等因素影響分析結(jié)果的實例揭示［J］.藥物分析雜志，2008，28（11）:1940－1944.

WANG Mingjuan，LI Yaping，HU Changqin.Examples of insufficiency of the stationery phase information described in official HPLC methods leading to different analytical results［J］.Chin J Parm Anal，2008，28（11）:1940－1944.

［5］ ROSA B，VICTORIA S N，JOSE B.Modeling retention in liquid chromatography as a function of solvent composition and pH of the mobile phase［J］.J Chromatogr A，2000，869:27－39.

［6］ VERVOORT R J M，DEBETS A J J，CLAESSENS H A，et al.Optimizationand characterization of silica－based reversed－phase liquid chromatographic systems for the analysis of basic pharmaceuticals［J］.J Chromatogr A，2000，897:1－22.

［7］ 李莉，徐海娥.在HPLC法測定保健食品及中藥制劑中化學(xué)降糖藥的含量［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009，19（6）:1271－1272.

LI Li，XU Haie.Determination of auti－diaetic agents in traditional Chinese medicine and health products by HPLC［J］.Chinese Journal of Health Laboratory Technology，2009，19（6）:1271－1272.

［8］ 黃作君，黎月玲，鄭企琨，等.高效液相色譜法測定人血漿中格列苯脲濃度［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24（1）:22－23.

HUANG Zuojun，LI Yueling，ZHENG Qikun，et al.Determination of glibenclamide in human plasma by HPLC［J］.Chin Hosp Pharm J，2004，24（1）:22－23.

［9］ 劉淑花，田華.高效液相色譜法測定消渴平膠囊中格列苯脲含量［J］.藥物鑒定，2010，19（23）:24－25.

LIU Shuhua，TIAN Hua.Determination of glibenclamide in Xiaokeping capsules by HPLC［J］.China Pharmaceuticals， 2010，19（23）:24－25.

［10］朱俐，尹利輝，金少鴻，等.HPLC快速檢測藥品的研究思路及其在降糖類藥品中的應(yīng)用［J］.藥物分析雜志，2013，33（3）:524－529.

ZHU Li，YIN Lihui，JIN Shaohong，et al.Research approach of rapidly determination by HPLC and the application in hypoglycemic drugs［J］.Chin J Pharm Anal，2013，33（3）:524－529.

［11］王明娟，李婭萍，楊亞麗，等.提高高效液相色譜法定性準(zhǔn)確性的方法探討［J］.藥物分析雜志，2006，26（1）:102－106.

WANG Mingjuan，LI Yaping，YANG Yali，et al.A primary study of standardizing HPLC retention indices of pharmaceutical related substances［J］.Chin J Pharm Anal，2006，26（1）:102－106.

［12］王明娟，李婭萍，胡昌勤.硅膠基質(zhì)C18柱的分類［J］.藥物分析雜志，2006，26（10）:1521－1526.

WANG Mingjuan，LI Yaping，HU Changqin.Classification of silica－based C18columns［J］.Chin J Pharm Anal，2006，26（10）:1521－1526.

［13］張偉清，胡昌勤.反相C18液相色譜柱選擇性理論及其應(yīng)用［J］.藥學(xué)學(xué)報，2010，45（5）:555－559.

ZHANG Weiqing，HU Changqin.Theory of selectivity of RPLC C18column and its application［J］.Acta Pharmaceutica Sinica，2010，45（5）:555－559.

［14］JONATHAN J，GILROY B，JOHN W D，et al.Column selectivity in reversed－phase liquid chromatography V:Higher metal content（type－A）alkyl－silica columns［J］.J Chromatogr A，2004，1026:77－89.

［15］GILROY J J，DOLAN J W，SNYDER L R.Column selectivity in reversed－phase liquid chromatographyⅣ:Type－B alkylsilica columns［J］.J Chromatogr A，2003，1000:757－778.

［16］WILSON N S，GILROY J，DOLAN J W，et al.Column selectivity in reversed－phase liquid chromatographyⅣ:Columns with embedded or end－capping polar groups［J］.J Chromatogr A，2004，1026:91－100.

［17］DEHOUCK P，DORA V，HEYDEN V，et al.Characterisation of reversed－phase liquid－chromatographic cloumns by chromatographic tests:Comparing column classification based on chromatographic parameters and column performance for the separation of acetylsalicylic acid and related compounds［J］.J Chromatogr A，2004，1025:189－200.

［18］DORA V，VANDER Y，HEYDEN V，et al.Characterisation of reversed－phase liquid－chromatographic tests:Rational column classification by a minimal number of column test parameters［J］.J Chromatogr A，2003，1012:11－29.

［19］中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范（2010年版）［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products.Chinese SOP Pharmaceutical Analysis（2010 Edition）［M］.Beijing:Chinese Medical Science and Technology Press，2010.