大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物耐藥機制的研究進展

劉云寧 李小鳳 韓旭穎 姜愛雯 王淑珍

·綜述與講座·

大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物耐藥機制的研究進展

劉云寧 李小鳳 韓旭穎 姜愛雯 王淑珍

大腸埃希菌;氟喹諾酮類;耐藥機制性

大腸埃希菌是革蘭陰性桿菌感染最常見的病原菌之一，據(jù)報道，全球每年因感染產(chǎn)毒素性大腸埃希菌而發(fā)病的患者達6.5億，并造成超過80萬5歲以下兒童死亡，我國不少地區(qū)大腸埃希菌在腹瀉病人的病原譜中占首位［1］。氟喹諾酮類藥物是治療大腸埃希菌感染的主要抗菌藥物，在20世紀80年代及90年代初大腸埃希菌中幾乎沒有耐氟喹諾酮類藥物的菌株，但隨著氟喹諾酮類(FQNS)的廣泛使用，2004至2005年度衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)監(jiān)測結果顯示，大腸埃希菌對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率分別為64.9%、56.7%;2011至2012年度衛(wèi)生部全國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)監(jiān)測結果顯示，大腸埃希菌對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的耐藥率分別為65.7%、61.6%。在我國臨床分離大腸埃希菌對FQNS的耐藥率處于全球前列。大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制主要為染色體介導和質粒介導［1］，包括:(1)編碼DNA解旋酶(DNA gyrase)和拓撲異構酶Ⅳ(topoisomeraseⅣ，TopoⅣ)靶酶的基因發(fā)生突變，降低了與氟喹諾酮類藥物的親和力而耐藥;(2)通過外排泵使抗菌藥物外排增加，同時使被排出的藥物不易再透過外膜進入菌體，從而降低藥物在菌體內蓄積;(3)細胞膜通透性改變，膜孔蛋白缺失或低表達，降低了水溶性抗菌藥物的透過，使細菌產(chǎn)生耐藥;(4)大腸埃希菌多重耐藥基因機制;(5)質粒編碼的氟喹諾酮類耐藥基因qnr、aac(6’)-Ib-er及qepA基因［2］。

1 編碼DNA解旋酶和拓撲異構酶Ⅳ靶酶的基因突變

氟喹諾酮類藥物對大腸埃希菌的作用機制是通過藥物可與在DNA復制與轉錄過程中形成的DNA-DNA解旋酶或DNA-拓撲異構酶Ⅳ復合物相結合，形成氟喹諾酮-DNA-DNA解旋酶或氟喹諾酮-DNA-拓撲異構酶Ⅳ三元復合物，阻止DNA解旋酶或拓撲異構構酶Ⅳ與DNA分子的分離，最終阻礙DNA復制與轉錄而造成細菌死亡。

對大腸埃希菌來說，氟喹諾酮類藥物的主要作用靶位為DNA解旋酶，次要靶位為拓撲異構酶Ⅳ;氟喹諾酮類藥物對細菌的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)主要由主要作用靶位決定，主要靶位的點突變可引起細菌對氟喹諾酮類藥物敏感性的降低，多個點突變或同時存在次要靶位的突變可使耐藥性進一步上升。

1.1 編碼DNA解旋酶的基因突變大腸埃希菌的DNA解旋酶由2個GyrA亞單位和2個GyrB亞單位組成，分別由gyrA和gyrB基因編碼，兩個基因中任何一個發(fā)生突變均可影響氟喹諾酮類藥物與靶位的結合，降低細菌對氟喹諾酮類藥物的敏感性，從而導致耐藥菌株的出現(xiàn)。在兩個基因突變型中以GyrA的突變?yōu)橹?，臨床上GyrB發(fā)生突變的幾率低于GyrA，但是研究表明GyrB的突變與細菌對氟喹諾酮類藥物的敏感性降低有關［3］。GyrB亞基上的426Asp→Asn和447Lys→Glu的突變已被確定。

目前在大腸埃希菌GyrA亞基上已發(fā)現(xiàn)有10個點突變可導致氨基酸被取代而引起耐藥，但GyrA的突變主要集中在其氟喹諾酮類耐藥決定區(qū)(Quino1one Resistance Determining Region，QRDR)內，即第199～318位核酸序列(編碼67Ala～106Gln)。大腸埃希菌的GyrA蛋白突變點主要是83Ser→Phe/Leu/Trp/Ala/ Tyr/Ile和87Asp→Asn/Phe/Ser/Thr/Ala/Tyr/Gly/ Val/Hls/Lys，其中以83Ser的取代最常見［4］。GyrA其他位點的取代方式:51Ala→Val、73Asp→Gly、82Asp→Gly、84Ala→Pro、93Ala→Ser/Thr和196Ala→Glu，但這些位點突變的頻率較低［5］。其他已有報道的突變67Ala→Ser、81Gly→Gys/Asp、106Gln→His/Arg和678Asp→Glu僅在外誘導的突變體中檢測到，并且突變頻率極低［5］。

1.2 拓撲異構酶靶酶的基因突變拓撲異構酶Ⅳ是由2個ParC亞基和2個ParE亞基組成(C2E2)的四聚體，其ParC亞單位和DNA解轉酶GyrA亞單位在NH2-末端蛋白序列的相似程度較高，即gyrA和parC同源，它們的NH2-末端均有與QRDR有關的區(qū)域，這一區(qū)域發(fā)生結構性變化就可導致細菌喪失對氟喹諾酮類藥物的敏感性。研究表明，ParC和ParE發(fā)生點突變，可導致細菌產(chǎn)生更高的耐藥水平，其突變均是在編碼DNA解轉酶的基因發(fā)生突變的基礎上產(chǎn)生的，目前只有ParC或ParE單獨突變的耐藥菌株尚未見報道。在臨床上ParE突變的菌株非常罕見，這與其低水平耐藥有關，ParE常見的突變類型為445 Leu→His［6］。此外，在parE基因的QRDR區(qū)域之外也發(fā)現(xiàn)了與耐藥有關的突變，如444 Ile→Phe、458 Ser→Thr、475 Asp→Glu和529 Ile→Leu［6］。

parC基因突變以80Ser→Ile取代最為常見，其次為84 Glu→Gly/Lys/Val。另外，parC基因的78 Gly→Asp，以及QRDR區(qū)域外的56Ala→Thr和57 Ser→Thr也被確定與耐藥性有關［7］。ParC突變僅引起對氟喹諾酮類藥物低水平耐藥，只有與gyrA共同突變時才產(chǎn)生高水平耐藥。

2 外排泵使藥物外排增加，降低藥物在菌體內蓄積

大腸埃希菌對氟喹諾酮類藥物耐藥的另一個重要機制是能量依賴型外排泵的過量表達，促使藥物從菌體內外排，使到達作用靶位的藥量明顯減少，從而介導耐藥性的產(chǎn)生和發(fā)展。根據(jù)藥物外排泵消耗能量來源的不同分為兩類［8］:(1)能量來自跨膜轉運時質子泵或鈉離子的電化學梯度(質子依賴型)，包括易化子家族(major facilitator，MF)，主要與革蘭陽性菌的耐藥性有關，一般條件下在革蘭陰性菌不表達;耐藥結節(jié)細胞分化(resistance-nodulation-division，RND)家族，RND家族外排泵是革蘭陰性菌的主要外排泵;多藥/低聚糖-脂質/多糖翻轉酶超家族的多藥和有毒化合物外排泵(multidrug and toxic efflux，MATE)家族，MATE家族外排泵基因主要存在于革蘭陰性菌;小多重耐藥(small multidrug resistance，SMR)家族，SMR家族外排泵在一些革蘭陽性菌中被發(fā)現(xiàn)。(2)通過ATP水解獲得的能量將藥物泵出細胞的ATP結合盒(ATP binding cassette，ABC)家族(ATP依賴型)。

大腸埃希菌是主動外排系統(tǒng)最多的一種細菌，其外排泵介導的耐藥機制可以協(xié)助細菌產(chǎn)生高水平耐藥［8］，其中與氟喹諾酮類藥物排出有關的外排系統(tǒng)有:AcrA/B、EmrA/B、MdfA、AcrE/F、YdhE/NorE［9］。AcrB、EmrB為藥物分子轉運子，通過膜融合蛋白(MFP)類輔助蛋白AcrA、EmrA與外膜通道相連，從而排出藥物。其中，AcrA/B-TolC是大腸埃希菌最主要的多藥外排泵，當該系統(tǒng)失活時，菌株對藥物的MIC降低。AcrA/B-TolC屬于RND家族，由三部分組成: (1)AcrB，一個具有12個跨膜結構域的內膜蛋白;(2) TolC，外膜通道蛋白，雖然有人認為AcrA/B是利用TolC產(chǎn)生耐藥性，但有報道說在沒有TolC時，AcrA/B同樣可以將藥物排出;(3)AcrA，一種周漿間隙脂蛋白，有利于AcrB和TolC的連接，甚至可引起膜的部分融合形成內外膜之間的一條通道，將進入內膜的藥物直接泵出細菌體外。mdfA基因為超廣譜藥物外排基因，屬于MF家族，其編碼的MdfA是具有12個跨膜結構域的內膜蛋白，MdfA主要為外排氯霉素，但它也可引起低水平環(huán)丙沙星、諾氟沙星等氟喹諾酮類藥物外排［8］。YdhE是在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)的NorM同源物，因此YdhE也被命名為NorE，屬于MATE家族，也是具有12個跨膜結構域的內膜蛋白，耐藥機制與MdfA相似，將藥物泵入周漿間隙。

AcrAB、MdfA和YdhE/NorE中任一種外排泵的過度表達都可引起細菌對氟喹諾酮類藥物耐藥性增加3～6倍，但它們的作用是相互獨立的。

3 細菌膜通透性改變

抗菌藥物要發(fā)揮其抗菌作用，必須要到達菌體的靶位。對大腸埃希菌來說，氟喹諾酮類藥物到達靶位必須要通過由外膜和內膜構成的通透性屏障。在大腸埃希菌的外膜上存在OmpA、OmpF、OmpC、LamB和TSX等多種通道孔蛋白，但與其耐藥性相關的通道孔蛋白主要為OmpF和OmpC。大腸埃希菌可以通過改變跨膜通道孔蛋白的結構或減少跨膜通道孔蛋白的數(shù)量來阻止抗菌藥物的滲透，使其與抗菌藥物結合力降低，從而減少藥物在細胞內的積聚［9］。

在耐氟喹諾酮大腸埃希菌的染色體上已發(fā)現(xiàn)norB、norC、nfxC、nfxB和cfxB等多個染色體突變基因，當這些染色體的基因發(fā)生突變時，可以引起膜通透性降低，從而影響藥物的吸收引發(fā)耐藥的產(chǎn)生。這些基因沒有直接的表達產(chǎn)物，對鄰近的基因也沒有直接的調控作用，但攜帶這些突變基因的耐藥菌株都具有相同的表型外膜蛋白異常，尤其是親水性小分子藥物通道OmpF的減少或缺失，使細菌對氟喹諾酮類藥物的攝入減少，且與四環(huán)素、氯霉素等小分子親水性藥物有交叉耐藥。有研究表明，OmpC通道缺失的菌株對氟喹諾酮類藥物的敏感性不變，因此OmpF的減少或缺失是細菌膜通透性降低而引起耐藥的主要因素［10］。

OmpF和OmpC在大腸埃希菌中的表達以協(xié)調方式緊密相關，分別由ompF和ompC基因編碼，其在轉錄和翻譯上受OmpB的調節(jié)。micF基因產(chǎn)物MicF-mRNA也參與調節(jié)OmpF的翻譯，OmpF的mRNA5-末端與MicF-mRNA末端部分互補形成OmpF-mRNAMicF-mRNA雙聚體，干擾ompF基因的轉錄，最終導致OmpF蛋白合成量降低，從而減少藥物在細菌內的積聚。

4 多重耐藥基因機制

大腸埃希菌多重耐藥(Multiple antibiotic resistance，Mar)突變型由大腸埃希菌染色體mar區(qū)基因突變所致［11］，該基因位于大腸埃希菌染色體的34分位，含有marRAB和marCD兩個操縱子，其中marRAB調控大腸埃希菌的多重耐藥［11］，marRAB操縱子過量表達可使細菌耐受氟喹諾酮類藥物的快速殺滅。mar-RAB包括抑制基因marR、激活基因marA、操縱基因marO和起輔助作用的marB，大小約1.3 kb。

marA基因的表達調控大腸埃希菌的多重抗生素耐藥，其編碼的MarA蛋白是僅有127個氨基酸殘基的小分子量蛋白質，MarA的過量表達足以引起大腸埃希菌多重耐藥性的形成［12］。文獻報道，MarA具有能與DNA相結合的螺旋結構，可作為全局性調節(jié)因子來調控遠距離的染色體基因的表達，誘導多重耐藥的產(chǎn)生［12］。MarA的過度表達還可以增強外排泵系統(tǒng)AcrAB-TolC的活性并使外膜蛋白OmpF減少，從而降低細胞內藥物濃度，影響細菌對抗菌藥物的敏感性。

marR基因編碼的MarR蛋白為抑制蛋白，其功能是作用于操縱基因-激活基因區(qū)，負性地調控著mar-RAB操縱子。實驗證實MarR與MarO有兩個接觸部位點:第一位點位于-35轉錄起始信號的下游包括-10信號的4 bp DNA，第二位點始于上一位點下游13bp處，終止于marR的第一對堿基。MarR與兩個部位結合均可影響marRAB的轉錄，但第二位點的缺失并不影響MarR與第一位點的結合。

5 質粒介導的氟喹諾酮類耐藥基因

目前已報道的大腸埃希菌質粒介導的喹諾酮類耐藥機制(plasmid-mediated quinolone resistance，PMQR)主要有三種［13］:(1)是qnr基因，以及其不同的等位基因，包括qnrA、qnrS、qnrB、qnrC和qnrD［14］;(2)是能降低環(huán)丙沙星活性的氨基糖苷乙酰轉移酶變種aac (6’)-Ib-cr［15］;(3)是喹諾酮類藥物特異性外排泵基因qepA和oqxAB［16］。

5.1 質粒介導的qnr基因1998年Martinez-Martinez等在研究一株膜蛋白缺失的肺炎克雷伯菌攜帶的質粒pMG252的多重耐藥性時首次發(fā)現(xiàn)PMQR機制的存在，之后在膜孔蛋白完好的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)質粒pMG252同樣能使氟喹諾酮類藥物的MIC升高8～64倍，從而證實質粒pMG252上編碼了可介導氟喹諾酮類藥物耐藥的相關基因，并將此基因命名為qnr(現(xiàn)命名為qnrA1)［17］。隨著對可轉移氟喹諾酮耐藥性質粒研究的深入，先后又發(fā)現(xiàn)了qnrS、qnrB、qnrC和qnrD［17］。qnr基因通常不影響藥物在菌體內的聚集，但qnr編碼的蛋白Qnr可以與拓撲異構酶的全酶或亞基、GyrA亞基和GyrB亞結合形成Qnr-復合物，該復合物的形成先于氟喹諾酮-DNA-拓撲異構酶復合物的形成，當Qnr與DNA解旋酶結合后，細菌減少了可以被氟喹諾酮類藥物抑制的靶位，同時也使其構象結構發(fā)生改變干擾藥物對靶位酶的識別，從而降低了細菌對氟喹諾酮類藥物的敏感性。研究還發(fā)現(xiàn)qnr對拓撲異構酶Ⅳ也有類似的保護作用［8］。

qnrA基因為一個657 bp大小的開放閱讀區(qū)，其編碼的蛋白QnrA含218個氨基酸，QnrA是一種靶位保護蛋白，屬于五肽重復家族，它通過與DNA解旋酶的全酶或亞基結合，保護靶位酶不受氟喹諾酮類藥物的抑制而介導耐藥。之后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)QnrA相近的某些蛋白質如QnrA2-QnrA7［18］。

qnrS基因首先發(fā)現(xiàn)于福氏志賀菌中，大小為47 kb，其編碼蛋白QnrS含218個氨基酸，與QnrA同源性為59%［19］。迄今為止qnrS共發(fā)現(xiàn)8個變種，qnrS 1～qnrS 8［20］。

2006年新發(fā)現(xiàn)的PMQR基因qnrB1和qnrB2，也來自肺炎克雷伯菌，其編碼的蛋白QnrB1和QnrB1分別含有226和215個氨基酸，QnrB1與QnrA和QnrS的同源性分別為39.5%和37.4%。到目前為止QnrB的亞型最多，已經(jīng)從QnrB1變化到了QnrB73共73個亞型。

qnrC基因是從奇異變形桿菌中分離得到，其大小為666bp，編碼的蛋白QnrC含有221個氨基酸。但至今未見在大腸埃希菌中檢測出qnrC的報道。

qnrD存在于大小為4 270 bp的質粒上，首先從沙門菌中分離得到，其編碼的蛋白含214個氨基酸。研究證實，含有該基因的大腸埃希菌對環(huán)丙沙星的MIC提高了32倍［21］。

qnr基因僅介導低水平的氟喹諾酮耐藥，但攜帶其耐藥基因的菌株在使用氟喹諾酮類藥物進行治療時可以誘導產(chǎn)生高水平耐藥菌株，實驗表明攜帶pMG 252質粒的大腸埃希菌相比不帶pMG 252的菌株發(fā)生自發(fā)突變的概率高100倍。同時質粒介導的qnr基因具有水平傳播性，可以跨種廣泛傳播，從而導致耐藥性擴散。5.2aac(6＇)-Ib-cr耐藥基因2006年Robicsek等［15］通過實驗證實氨基糖苷乙酰轉移酶的變異基因aac(6＇)-Ib-cr編碼的滅活酶可引起較高水平的氟喹諾酮耐藥。aac(6＇)-Ib-cr是aac(6＇)-Ib的一個突變體，其編碼的蛋白質Aac(6＇)-Ib-cr含有172個氨基酸，aac (6＇)-Ib-cr的序列比aac(6＇)-Ib在編碼區(qū)上游多出12bp長的獨特堿基對。Aac(6＇)-Ib-cr有兩個突變點即:102Trp→Arg和179Asp→Tyr。雙位點的突變使Aac(6＇)-Ib-cr在保持對抗氨基糖苷類藥物的同時還可以和氟喹諾酮類藥物親和，但它對氨基糖苷類藥物的親和力要遠大于氟喹諾酮類，Maurice等［22］認為l79Asp→Tyr的突變和氟喹諾酮藥物結合有關。Aac(6＇)-Ib-cr通過與哌嗪環(huán)上的“NH”發(fā)生乙?；磻档图毦幬锏拿舾行?，因此aac(6＇)-Ib-c介導的耐藥僅對含哌嗪基氨基氮的環(huán)丙沙星和諾氟沙星才具有作用。

5.3 喹諾酮類藥物特異性外排泵基因qepA和oqxAB

Yamane等［23］在分離大腸桿菌質粒pHPA時發(fā)現(xiàn)了一種新的外排泵基因qepA，該基因由1 536 bp核苷酸構成，其編碼的蛋白QepA(后命名為QepA1)含有511個氨基酸，QepA為質子依賴型外排蛋白，由14個跨膜片段組成，屬于主要易化超家族，它介導了對氟喹諾酮類、氨基糖苷類和廣譜β-內酰胺類藥物的耐藥。研究證實，攜帶qepA的菌株對環(huán)丙沙星和諾氟沙星的MIC分別提高了32倍和64倍。Cattoir［24］發(fā)現(xiàn)了另一個新的外排泵蛋白QepA2，與QepA相比有兩個氨基酸發(fā)生突變，但不影響介導對氟喹諾酮類的耐藥。對qepA1和qepA2測序時發(fā)現(xiàn)，qepA1的側翼序列為兩個IS26復制子，與編碼氨基糖苷核糖體甲基酶的rmtB基因相關，而qepA2的側翼序列是一個插入序列元件ISCR3C，但與rmtB基因無關［24］。QepA對藥物的作用具有選擇性，研究表明，攜帶qepA基因的菌株對親水性氟喹諾酮類藥物(如環(huán)丙沙星和諾氟沙星等)的耐藥水平高10倍，而對疏水性氟喹諾酮類藥物(如左氧氟沙星和莫西沙星等)的MIC差異不大［25］。

Hansen等［26］研究證實大腸埃希菌對奧喹多司的耐藥是由一種新的藥物外排蛋白OqxAB所引起，該蛋白質由大腸埃希菌的一種質粒pOLA52編碼，屬于RND家族。OqxAB為多重藥物外排泵，它在介導氟喹諾類藥物耐藥的同時還介導對其他藥物(如氯霉素)的耐藥。對大腸埃希菌研究時發(fā)現(xiàn)oqxAB基因存在于43～115 kb的可轉移質粒中，攜帶該質粒的大腸埃希菌對環(huán)丙沙星的MIC提高了16倍［26］。

從目前的研究來看質粒介導的氟喹諾酮耐藥基因通常引起低水平耐藥，但攜帶這些耐藥基因的菌株在使用氟喹諾酮類藥物治療時比其他菌株更易誘導產(chǎn)生染色體靶位基因的突變，從而導致高水平耐藥菌株的快速出現(xiàn)，因此在治療過程中應引起重視，合理使用氟喹諾酮類藥物。

綜上所述，隨著氟喹諾酮類藥物在臨床上的廣泛應用，大腸埃希菌對其耐藥的現(xiàn)象日趨嚴重，而且耐藥機制也復雜多變。因此在深入研究其耐藥機制，研制新型抗菌藥物的同時更應該嚴格掌握氟喹諾酮類藥物的適應證，根據(jù)患者情況、藥敏結果等來選擇抗菌藥物以及其劑量和療程，從而減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

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2014-09-11)

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