禽流感滅活油乳劑疫苗的交叉保護(hù)作用

劉平平 （山東省諸城市畜牧獸醫(yī)管理局 262200）

禽流感(AI)是A型流感病毒(AIV)引起的禽類全身性或呼吸器官性傳染病，主要侵害雞、火雞、鴨和鵝等。我國(guó)《家畜家禽防疫條例》和國(guó)際獸疫局動(dòng)物流行病組織(OIE)規(guī)定該病為A類烈性傳染病。該病的毒型眾多、變異性極強(qiáng)、低致病性毒株能在短期內(nèi)變成高致病性毒株(HPAIV)，從而給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)毀滅性打擊。根據(jù)禽流感病毒血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)抗原性的變異情況，可以把它區(qū)分成很多亞型，目前已分離鑒定的AIV分為16個(gè)H亞型和10個(gè)N亞型。絕大部分禽流感病毒是無(wú)毒或低毒的，禽類感染后不表現(xiàn)任何臨床癥狀，只有少數(shù)毒株才引起臨床癥狀，甚至發(fā)生嚴(yán)重死亡。進(jìn)入80年代以來(lái)，引起高致病力禽流感流行的主要為H5和H7亞型。高致病性禽流感的暴發(fā)和流行，常常給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)毀滅性的經(jīng)濟(jì)損失。本文用AIV－H7N3進(jìn)行致病力檢測(cè)并制成油乳劑甲醛滅活疫苗，再用此疫苗和實(shí)驗(yàn)室提供的H5N1、H9N2油乳劑甲醛滅活疫苗對(duì)雞只進(jìn)行免疫，并用AIV－H5、AIV－H7、AIV－H9進(jìn)行交叉攻毒，檢測(cè)油乳劑滅活苗針對(duì)自身病毒攻擊的免疫效力和針對(duì)HA亞型不同的AIV抗原的交叉保護(hù)力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 非免疫雞胚 7日齡非免疫雞胚孵化至9～11日齡。

1.1.2 雞 1日齡石岐雜黃雞在動(dòng)物試驗(yàn)室隔離飼養(yǎng)至28日齡，期間不做任何免疫。

1.1.3 毒株、疫苗 AIV－H7毒株、H5N1、H9N2甲醛滅活油乳劑疫苗。

1.1.4 抗原與抗體 AIV－H5、AIV－H7、AIV－H9標(biāo)準(zhǔn)抗原和抗體。

1.1.5 主要試劑 10號(hào)白油、司本-80、吐溫-80、甲醛溶液、硬脂酸鋁、瓊脂糖、高速組織搗碎機(jī)、0.85%生理鹽水、青霉素、鏈霉素。

1.1.6 主要儀器及設(shè)備 AllegraTm64R Centrifuge臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、高速攪拌器Ultra-turrax、mICRO-mIXER振蕩器、臺(tái)式低速離心機(jī)TGL-16G。

1.1.7 其他試驗(yàn)材料 1ml 注射器(1 次性)若干，finnpipette digitaL10～50、50ul/200～1000ul各一只，96孔V型微量反應(yīng)板，標(biāo)記筆，過(guò)濾器(1次性)，西林瓶若干，打孔器，酒精燈，剪刀，鑷子，棉拭子。

1.2 方法

1.2.1 雞胚平均死亡時(shí)間(mDT)的測(cè)定 參照郭玉璞(1994)的方法稍加改進(jìn)。將無(wú)菌的含AIV－H7N3尿囊液用滅菌生理鹽水做倍比稀釋(10-2～10-9)，每一稀釋度經(jīng)尿囊腔途徑接種5枚非免疫雞胚，0.2ml/胚，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照，35℃培養(yǎng)7d。照胚2次/d，記錄死亡胚數(shù)及其死亡時(shí)間，收獲尿囊液測(cè)定HA效價(jià)。使所有雞胚死亡的最高稀釋倍數(shù)為病毒的最小致死劑量，mDT的計(jì)算公式：

根據(jù)最小致死量的雞胚平均死亡時(shí)間的指標(biāo)測(cè)定，雞胚平均死亡時(shí)間(mDT)，弱毒為90h以上，中毒為60～ 90h，強(qiáng)毒為40～60h。

1.2.2 甲醛滅活油乳劑疫苗的制備和檢測(cè) （1）疫苗的種毒滅活：將增殖后的病毒接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱營(yíng)養(yǎng)瓊脂無(wú)菌檢驗(yàn)合格后，測(cè)定其HA效價(jià)，選擇HA效價(jià)≥29抗原用0.1%的甲醛溶液37℃作用48h滅活，并用滅活的絨毛尿囊液接種敏感雞胚檢驗(yàn)滅活效果。4℃下保存?zhèn)溆?。?）甲醛滅活油乳劑疫苗的配制方法：按照羅開健(1999)的方法配制。水相配制：將滅菌吐溫-80按3%(V/V)加入滅活抗原內(nèi)，攪拌混合均勻。油相配制：10號(hào)白礦油、司本-80、硬脂酸鋁按94:6:2比例通過(guò)加勢(shì)攪拌溶化后，121℃高壓滅菌20min，置室溫保存?zhèn)溆?。疫苗配制：將水相與油相按2:3比例，先將油相傾入膠體磨中攪拌，再緩慢加入水相，加完后循環(huán)攪拌4min，使混合物充分乳化，即為乳白色的油乳劑滅活疫苗。共制備3批疫苗。（3）甲醛滅活油乳劑疫苗質(zhì)量的檢測(cè)：疫苗的無(wú)菌檢測(cè)：將配制的疫苗接種普通培養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃溫育96h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。疫苗的外觀檢測(cè)：肉眼觀察上述滅活疫苗的外觀。疫苗的穩(wěn)定性檢測(cè)：取一部分疫苗置離心管中，3500r/min離心15min，觀察疫苗有無(wú)分層及破乳的情況出現(xiàn)，并放室溫繼續(xù)觀察。疫苗劑型檢測(cè)：將以上油乳劑疫苗分別滴于冷水表面，疫苗不分散為油包水型，分散則為水包油型。疫苗的粘度檢測(cè)：在室溫25℃下用1ml吸管(下口內(nèi)徑1.2mm，上口內(nèi)徑2.7 mm)吸取疫苗1ml，使其垂直流出0.4ml的時(shí)間應(yīng)不超過(guò)8s。疫苗的安全性檢測(cè)：取5、15、28d齡石岐雜黃雞各8只，按疫苗常規(guī)免疫劑量(5～15d齡：0.3ml/只、28d齡：0.5ml/只)的4倍即各1.2ml/只、2ml/只，在左右兩邊肩部肌肉注射試驗(yàn)雞，觀察2w，并剖殺試驗(yàn)雞檢查注射部位有無(wú)異常。

1.2.3 流感各亞型之間的交叉保護(hù)試驗(yàn) 將96只28d齡的雞隨機(jī)分成12組，每組8只；I、II、III組用H5N1油苗以0.5ml/只劑量進(jìn)行免疫，免后3w分別以102LD50×0.2ml的H5、105EID50×0.5ml的H7、105EID50×0.2ml的H9進(jìn)行肌注攻毒；IV、V、VI組用H7N3油苗以 0.5ml/只劑量進(jìn)行免疫，免后3w分別以102LD50×0.2ml的H5、105EID50×0.5ml的H7、105EID50×0.2ml的H9進(jìn)行肌注攻毒；VII、VIII、IX組用H9N2油苗以0.5ml/只劑量進(jìn)行免疫，免后3w分別以102LD50×0.2ml 的H5、105EID50×0.5ml 的H7、105EID50× 0.2ml的H9進(jìn)行肌注攻毒；X、XI、XII組用陰性尿囊液制成的油苗以0.5ml/只劑量進(jìn)行免疫，免后3w 分別以102LD50×0.2ml的H5、105EID50×0.5ml的H7、105EID50×0.2 ml的H9進(jìn)行肌注攻毒；同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組8只。攻毒后觀察10d，同時(shí)在攻毒后3d采集攻以H7、H9各組的拭子并分離病毒，觀察疫苗的免疫保護(hù)效果。

2 結(jié)果

2.1 雞胚平均死亡時(shí)間(mDT)

經(jīng)測(cè)定，AIV－H7N3毒株的雞胚平均死亡時(shí)間(mDT)為138h，根據(jù)最小致死量的雞胚平均死亡時(shí)間的指標(biāo)測(cè)定，證明AIV－H7N3毒株為弱毒株。

2.2 甲醛滅活油乳劑疫苗

疫苗的種毒滅活效果：滅活的絨毛尿囊液接種敏感雞胚檢驗(yàn)滅活效果為病毒已完全滅活。甲醛滅活油乳劑疫苗質(zhì)量的檢測(cè)結(jié)果：疫苗乳化效果良好，無(wú)分層、破乳現(xiàn)象，疫苗為油包水型，垂直流出0.4ml的時(shí)間沒有超過(guò)8s，結(jié)果證明該疫苗是穩(wěn)定的。甲醛滅活油乳劑疫苗安全性檢測(cè)結(jié)果：疫苗以不同劑量接種不同日齡的雞只均未出現(xiàn)不良反應(yīng)，精神狀態(tài)良好，食欲正常，接種部位無(wú)腫脹發(fā)熱等不良反應(yīng)，剖殺這些免疫雞，注射部位也無(wú)異常反應(yīng)，說(shuō)明這些油乳劑疫苗對(duì)試驗(yàn)雞是安全的。

2.3 流感各亞型之間的交叉保護(hù)

表1 流感各亞型之間的交叉保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表1

3 討論

（1）本試驗(yàn)以司本-80為油相的乳化劑，硬脂酸鋁為穩(wěn)定劑，以吐溫-80作為水相的乳化劑，水相與油相的比例為2:3，所研制的疫苗的物理性狀及免疫效力均較為理想。（2）流感各亞型之間的交叉保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，用AI毒株所制油苗用同亞型AIV攻擊均獲完全保護(hù)，進(jìn)一步證明了用甲醛作滅活劑制備的油乳劑滅活疫苗對(duì)同亞型AIV的感染有較強(qiáng)的保護(hù)作用，這為油乳劑滅活疫苗應(yīng)用在生產(chǎn)實(shí)踐中提供了良好的試驗(yàn)基礎(chǔ)。而用不同亞型AIV攻擊其交叉保護(hù)力，H5N1滅活疫苗在免疫后3w時(shí)對(duì)AIV－H7、AIV－H9攻擊為2/8保護(hù)，H7N3免對(duì)AIV－H9攻擊為2/8保護(hù)，H9N2免對(duì)AIV－H5攻擊則為0/8保護(hù)，表明HA亞型不同的AIV抗原之間的交叉保護(hù)力是比較低的，其中對(duì)強(qiáng)毒H5N1的保護(hù)作用幾乎為0。AIV亞型多且易產(chǎn)生變異，不同的HA亞型間缺乏良好的交叉保護(hù)性，因此單價(jià)AIV滅活疫苗在生產(chǎn)中的使用受到了一定的限制，現(xiàn)滅活苗可選用當(dāng)?shù)亓餍兄昊驀?guó)際準(zhǔn)株制成多價(jià)苗，而且亞型抗原之間不產(chǎn)生免疫干擾。所以，用AIV油乳劑滅活苗控制禽流感是切實(shí)可行的，必將給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)明顯的經(jīng)濟(jì)效益。由于試驗(yàn)雞只數(shù)量所限，本試驗(yàn)所進(jìn)行的流感各亞型之間的交叉保護(hù)試驗(yàn)，如果將試驗(yàn)雞只數(shù)量增多，可能會(huì)有其他收獲，有待進(jìn)一步研究