致病性曲霉的耐藥性研究進展

王千，李若瑜，劉偉

北京大學第一醫(yī)院皮膚性病科，北京大學真菌與真菌病研究中心，皮膚病分子診斷北京市重點實驗室，北京 100034

致病性曲霉的耐藥性研究進展

王千，李若瑜，劉偉

北京大學第一醫(yī)院皮膚性病科，北京大學真菌與真菌病研究中心，皮膚病分子診斷北京市重點實驗室，北京 100034

隨著抗真菌藥物在臨床上的廣泛使用，致病性真菌的耐藥率越來越高，耐藥曲霉對侵襲性曲霉病的診治產(chǎn)生了重要影響。目前，致病性曲霉耐藥性的確定主要依靠抗真菌藥敏試驗和分子診斷。在有關曲霉耐藥機制的研究中，報道最多的是曲霉對唑類藥物的耐藥，其機制主要包括外排泵表達增加、靶酶Cyp51突變和表達水平增高、形成生物膜，以及熱休克蛋白90(Hsp90)介導的信號通路參與而導致的耐藥。本文就上述領域近年來的主要進展進行綜述。

曲霉;耐藥;唑類抗真菌藥物

近年來，隨著實體器官移植和骨髓移植的開展、糖皮質(zhì)激素的應用等，免疫受損個體不斷增多。同時，由于抗生素的大量使用引起體內(nèi)菌群失調(diào)，導致侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis)的發(fā)病率不斷上升。80%的侵襲性曲霉病由煙曲霉(Aspergillus fumigatus)引起，15% ～20%由黃曲霉引起，少數(shù)由黑曲霉和土曲霉引起［1］。

目前治療侵襲性曲霉病的藥物主要有4類:多烯類，如兩性霉素B;三唑類，如伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑;棘白菌素類，如卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈［2］;烯丙胺類，如特比萘芬。雖然侵襲性曲霉病的診斷和治療水平不斷提高，但其病死率仍很高，耐藥菌株的出現(xiàn)是導致治療失敗的重要原因，感染耐唑類曲霉的侵襲性曲霉病患者病死率高達88%［3］。因此，對曲霉的耐藥性進行早期診斷、研究曲霉的耐藥機制有利于檢測和控制耐藥曲霉病的發(fā)生?，F(xiàn)就有關致病性曲霉的耐藥性進展作一簡要綜述。

1 抗真菌藥敏試驗及曲霉耐藥菌株的確定

可靠的藥敏試驗能指導臨床合理選擇抗真菌藥物及監(jiān)測臨床療效。目前臨床上使用的藥敏試驗方法主要包括肉湯常量和微量稀釋法、瓊脂擴散法、紙片擴散法和E-test法。這些技術在費用、重復性、方法之間的兼容性及結果的解釋方面均有所不同［4］。

致力于提高體外藥敏試驗的可重復性和客觀性，美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)于2008年推出了針對絲狀真菌敏感試驗的標準化方法M38-A2，歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)也推出了針對絲狀真菌藥敏試驗的標準化方法E.DEF.9.1。這些藥敏試驗方法的標準化對確定致病性曲霉的耐藥菌株具有重要意義。同時，有學者建議使用微量稀釋法確立唑類藥物對煙曲霉的判讀折點:當伊曲康唑和伏立康唑的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)＜2 mg/L時為敏感，MIC=2 mg/L為中介，MIC＞2 mg/L為耐藥;對于泊沙康唑，MIC＜0.25 mg/L、0.25＜MIC＜0.5 mg/L和MIC＞0.5 mg/L分別為敏感、中介和耐藥［5］。更多的多烯類和棘白菌素類藥敏終點判定的標準化工作正在進行，判讀折點和藥敏試驗的具體方法還有待進一步確定。

2 曲霉耐藥的分子診斷

曲霉耐藥的分子診斷方法:通過設計引物，利用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)特異擴增曲霉基因組(包含待檢測突變位點的基因序列)，隨后將其與包含突變位點的陽性序列進行比對，判斷該曲霉是否發(fā)生了特定位點突變導致的耐藥［6］。目前，煙曲霉對唑類藥物耐藥的分子診斷方法主要是檢測cyp51A基因中的突變。PCR的模板DNA多來源于臨床菌株培養(yǎng)后收集、提取的基因組DNA［7］。

但Spiess等利用改良PCR，可直接將送檢標本中提取的DNA作為模板，對目的基因進行PCR擴增，檢測cyp51A中的突變熱點及啟動子區(qū)插入的重復序列。目前可檢測的耐藥突變位點包括M220、TR34［8］、L98H［9］和TR46［6］。

3 耐藥機制

3.1 對多烯類藥物耐藥

多烯類抗真菌藥物通過與真菌細胞膜上的麥角固醇直接結合，造成細胞膜對單價和二價陽離子的通透性增加，最終導致細胞死亡。目前用于治療侵襲性曲霉病的多烯類藥物主要包括兩性霉素B脫氧膽酸(D-AMB)及其含脂制劑(LFAB)(如兩性霉素B脂質(zhì)復合體、兩性霉素B脂質(zhì)體和兩性霉素B膠質(zhì)分散體)。其中D-AMB可用于侵襲性曲霉病的初始治療［2］。

在曲霉屬中，除土曲霉對兩性霉素B天然耐藥外，其繼發(fā)耐藥較少見，偶可發(fā)生于嚴重免疫抑制患者。關于致病性曲霉是否對多烯類藥物產(chǎn)生耐藥性，CLSI的M38-A2方案并沒有對兩性霉素B體外藥敏試驗MIC判讀的折點作出明確規(guī)定。但有研究表明，體外藥敏試驗中對兩性霉素 B MIC≥2 mg/L的菌株，在感染動物模型中對兩性霉素B的治療無反應［10］。此外，有學者利用藥代-藥效模型模擬體內(nèi)兩性霉素B的血藥濃度，確立了兩性霉素B對煙曲霉的判讀折點:MIC≤0.5 mg/L、0.5＜MIC＜2 mg/L和≥2 mg/L分別表示敏感、中介和耐藥［11］。

曲霉對兩性霉素B耐藥的機制目前尚不明確，而土曲霉對兩性霉素B天然耐藥。以前有研究認為，細胞膜麥角固醇減少是導致土曲霉對唑類藥物耐藥的重要因素［12］。然而，Blum等通過比較兩性霉素B耐藥土曲霉與敏感土曲霉，發(fā)現(xiàn)兩者細胞壁中麥角固醇的含量無顯著差異，但耐藥株胞內(nèi)藥物濃度低于敏感株，且抗氧化水平更好，表明麥角固醇的含量減少并非耐藥的主要影響因素［13］。

3.2 對唑類藥物耐藥

唑類藥物通過抑制麥角固醇合成途徑中的細胞色素P450 14α-去甲基酶(Cyp51)，引起羊毛固醇積聚及麥角固醇缺乏，使真菌細胞膜合成受阻，從而導致真菌細胞破裂而死亡。唑類藥物包括氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑等，后三者目前均可用于侵襲性曲霉病治療。根據(jù)2008年美國感染病學會(Infectious Diseases Society of America，IDSA)公布的曲霉病治療指南，伏立康唑被推薦為治療侵襲性曲霉病的首選藥物，伊曲康唑可用于補救治療，泊沙康唑可用于粒細胞缺乏、白血病或骨髓增生異常綜合征患者，以及發(fā)生移植物抗宿主病的同種異體造血干細胞移植受者等易發(fā)生曲霉病高危患者的預防治療。歐洲尚批準泊沙康唑用于伊曲康唑治療無效的侵襲性曲霉病［2］。

1997年Denning首次描述了煙曲霉對伊曲康唑產(chǎn)生耐藥性［14］。之后，有關耐唑類藥物的煙曲霉菌株報道增多，且部分菌株對伏立康唑等唑類藥物交叉耐藥?？梢灶A測，致病性曲霉對唑類藥物的耐藥性將對侵襲性曲霉病治療藥物的選擇產(chǎn)生重要影響。目前，已知致病性曲霉對唑類藥物的耐藥機制主要有以下幾種。

3.2.1 藥物外排機制外排泵基因過表達使外排泵作用增強，細胞內(nèi)唑類藥物含量減少導致煙曲霉耐藥。煙曲霉藥物外排泵包括兩類:一是ATP結合盒(ATP-binding cassette，ABC)蛋白，二是主要協(xié)助轉(zhuǎn)運蛋白超家族(major facilitator superfamily，MFS)?；蚪M分析顯示，煙曲霉基因組中包含49個ABC轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因和278個MFS轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因［15，16］。2002年Slaven等首次克隆了煙曲霉中的外排泵基因atrf，并用斑點雜交方法證實了伊曲康唑耐藥株中atrf表達量是敏感株的5倍［17］。最近，F(xiàn)raczek等對曼徹斯特地區(qū)的耐藥曲霉進行分析，發(fā)現(xiàn)＞50%的耐藥菌株無cyp51A或啟動子區(qū)突變，并對非cyp51A突變的耐藥機制進行了研究。研究表明，外排泵基因cdr1B過表達與耐唑類藥物有關［18］，但仍需開展大規(guī)模的基因過表達分析及基因敲除研究，以確定影響藥物外排泵基因表達的信號轉(zhuǎn)導通路和轉(zhuǎn)錄因子在耐藥發(fā)生中的作用。

3.2.2 cyp51A基因突變Cyp51是唑類藥物的作用靶點，煙曲霉中唑類藥物靶酶的編碼基因有cyp51A和 cyp51B，黃曲霉中有 cyp51A、cyp51B和cyp51C，目前已明確煙曲霉的cyp51A突變與對唑類藥物的耐藥性密切相關。研究表明，煙曲霉cyp51A基因突變引起的靶酶Cyp51中G138和G448氨基酸替換導致其對伏立康唑和伊曲康唑耐藥;M220和G54的氨基酸替換能導致對伊曲康唑和泊沙康唑耐藥;M236的氨基酸替換能導致對伊曲康唑耐藥［5］。

2007年，荷蘭科學家發(fā)現(xiàn)很多侵襲性曲霉病患者(包括未使用過唑類藥物治療的原發(fā)患者)感染了對唑類藥物交叉耐藥的曲霉菌株，并發(fā)現(xiàn)其耐藥機制主要是由于TR34/L98H，即cyp51A基因啟動子區(qū)34 bp串聯(lián)重復序列插入及編碼區(qū)98位亮氨酸突變?yōu)榻M氨酸［19］。2007～2011年，有6個歐洲國家(英國、西班牙、比利時、丹麥、法國和挪威)相繼報道了 TR34/L98H類型耐藥菌株。2012～2013年，更多國家報道了TR34/L98H耐藥菌株，其中包括來自德國的首次報道和法國的后續(xù)報道。關于原發(fā)耐藥菌株的來源，有學者利用基因標記技術檢測了142株歐洲分離的耐藥菌株，發(fā)現(xiàn)TR34/L98H菌株的基因變異比敏感株或其他耐藥機制的菌株少。這表明歐洲的TR34/L98H耐藥株有共同的祖先，可能是在荷蘭，以后遷移至整個歐洲。相反，印度的TR34/L98H菌株(包括環(huán)境株和臨床分離株)均有相同的微衛(wèi)星基因型，但這種基因型未在其他區(qū)域發(fā)現(xiàn)，推測可能是唑類耐藥菌株與印度本土菌株雜交的結果［20］。

最近有學者在荷蘭報道了cyp51A基因啟動子區(qū)46 bp串聯(lián)重復序列插入和編碼區(qū)121位、289位氨基酸替換(TR46/Y121F/T289A)的突變類型，可導致煙曲霉對伏立康唑耐藥［21］。隨后比利時學者也報道了這種基因型，表明其有地理上的擴散［22］。本課題組新近確定，煙曲霉TR34/L98H菌株合并出現(xiàn)基因突變所致的T248N和L307P介導了對伏立康唑和伊曲康唑的交叉耐藥［23］。另外，還在國際上首次確定cyp51C的T788G錯義突變可導致黃曲霉對伏立康唑耐藥［24］。

3.2.3 熱休克蛋白90熱休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)是一種常見的分子伴侶。研究表明，Hsp90可通過依賴鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)途徑調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導，主要參與假絲酵母(又稱念珠菌)對唑類、曲霉對棘白菌素類藥物的適應性反應，使真菌出現(xiàn)快速耐藥。Cowen等通過構建Hsp90表達量不同的菌株Lo90(低)、Re90(中)和Hi90(高)進行實驗，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)Hsp90含量與真菌耐藥性有關，含量越高耐藥性越強，如果Hsp90缺失，耐藥性也隨之消失;Hsp90對基因組各類突變及Erg3介導的耐藥性都是必需的［25］;耐藥性一旦出現(xiàn)，則菌株對Hsp90不再具有依賴性［26，27］。Hsp90抑制劑格爾德霉素聯(lián)合卡泊芬凈或他克莫司對唑類耐藥菌株有殺菌作用［28］。此外，Hsp90的賴氨酸殘基去乙酰化對Hsp90活化具有重要意義，賴氨酸去乙?；?lysine deacetylase，KDAC)抑制劑可阻斷Hsp90活化，從而抑制耐藥性出現(xiàn)并增加曲霉的敏感性［29］。

此外，Hsp90可能還通過調(diào)節(jié)其他信號途徑來介導真菌對各種壓力的反應［25］，是一種新型抗真菌藥物的作用靶點。

3.2.4 曲霉生物膜的形成生物膜是由細胞外多聚基質(zhì)包裹的菌絲相互黏附構成的有結構的微生物群落，是相對于游離狀態(tài)菌而言的微生物另一種存在方式。本課題組研究表明，煙曲霉可形成生物膜［30］，曲霉生物膜可通過藥物外排泵基因和唑類靶酶基因的表達量升高而對藥物產(chǎn)生耐藥［31］，棘白菌素類藥物與唑類藥物或兩性霉素B聯(lián)用可發(fā)揮對曲霉生物膜的協(xié)同殺傷作用［32］。

3.3 對棘白菌素類藥物耐藥

棘白菌素類藥物作用于真菌細胞壁，通過抑制1，3-β-D-葡聚糖合成酶，影響真菌細胞壁合成，使真菌生長過程中細胞壁葡聚糖缺乏、滲透壓失常而最終導致細胞溶解［2］。目前臨床常用的棘白菌素類藥物有卡泊芬凈、米卡芬凈及阿尼芬凈。

2008年，Eschertzhuber從1例心臟移植術后并發(fā)侵襲性曲霉病患者體內(nèi)分離出1株耐卡泊芬凈黃曲霉［33］。目前，耐棘白菌素類曲霉仍少見。Rocha等通過研究從實驗室分離獲得的耐卡泊芬凈煙曲霉，發(fā)現(xiàn)其耐藥機制主要是由于編碼葡聚糖合成酶的基因fks1突變引起678位氨基酸替代(S678P)，導致卡泊芬凈、阿尼芬凈、米卡芬凈的最低有效濃度(minimal effect concentration，MEC)升高至 16 mg/L［34］。

此外，Lewis等利用感染了煙曲霉野生株和AfFKS1突變株(S678P)的中性粒細胞減少的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)卡泊芬凈、阿尼芬凈的給藥量每日＞0.5 mg/kg時能有效降低野生株負荷，但只有當卡泊芬凈給藥量每日＜1 mg/kg、阿尼芬凈給藥量每日＞4 mg/kg時才能有效降低突變株負荷，證實Fks1中S678P突變導致菌株耐藥［35］。

但對臨床耐棘白菌素類曲霉的耐藥機制，由于缺乏臨床耐藥菌株而未能進行更深入的研究和報道。

3.4 對烯丙胺類藥物耐藥

烯丙胺類抗真菌藥物通過抑制真菌的角鯊烯環(huán)氧化酶阻斷真菌細胞麥角固醇的合成，進而破壞其細胞膜的生成。雖然烯丙胺類藥物主要用于淺部真菌病的治療，但有證據(jù)表明真對侵襲性曲霉病也有一定的療效15?。代表藥物有萘替芬、特比萘芬、布替萘芬等。有關特比萘芬耐藥的報道較少，但有研究表明，煙曲霉角鯊烯環(huán)氧化酶編碼基因ergA突變使389位氨基酸被替代(F389L)，可導致煙曲霉對特比萘芬耐藥［36］。另外，靶酶基因拷貝數(shù)增加也可導致煙曲霉對特比萘芬耐藥［37］。

4 結語

目前臨床上治療侵襲性曲霉病的首選藥物是唑類，但耐唑類菌株的出現(xiàn)使其在臨床上的應用受到限制。因此，建立標準化的藥敏試驗手段，開展分子診斷方法，深入研究致病性曲霉的耐藥機制，將有利于抗真菌藥物的合理使用和控制真菌耐藥的發(fā)生。

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The progress in antifungal resistance of pathogenic Aspergillus spp.

WANG Qian，LI Ruo-Yu，LIU Wei
Department of Dermatology，Peking University First Hospital，Research Center for Medical Mycology，Beijing Key Laboratory of Molecular Diagnosis on Dermatoses，Peking University，Beijing 100034，China

With the wide use of antifungals in the clinic，there have been increasing reports of resistant strains of Aspergillus spp.to antifungals.The resistance of Aspergillus spp.has important impact on the diagnosis and treatment of invasive aspergillosis.Currently，the determination of antifungal resistance of pathogenic Aspergillus spp.relies on antifungal susceptibility testing and molecular detection.Recently，the resistance of Aspergillus spp.to antifungals is mainly focused on azole antifungals.The research progress on antifungal resistance of pathogenic Aspergillus spp.，including the diagnosis for resistance and the molecular mechanisms，such as over-expression of efflux pumps，mutations in the target enzyme(Cyp51)，formation of biofilm and heat shock protein 90(Hsp90)-mediated signaling pathways are reviewed.

Aspergillus spp.;Drug resistance;Azole antifungals

.LIU Wei，E-mail:liuwei@bjmu.edu.cn

2014-11-18)

國家自然科學基金(81471925)，教育部“新世紀人才支持計劃”(NCET-10-0198)

劉偉