高壓氧對兔頸內(nèi)動(dòng)脈和基底動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究＊

范禎禎，劉志艷，蔡宏斌，張翠杰，張旭東，張?zhí)m芳，梁 成，葛朝明△

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，蘭州730030；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院高壓氧中心，蘭州730000）

流行病學(xué)調(diào)查顯示，腦血管疾病、顱腦損傷及各種中毒性腦病已成為嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量的三大疾病。目前高壓氧（hyperbaric Oxygen，HBO）對一氧化碳中毒、顱腦外傷的療效已得到廣泛的認(rèn)可［1］。本文通過檢測HBO對兔頸內(nèi)動(dòng)脈和基底動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Caspase－3、Bcl－2mRNA表達(dá)的影響，探討HBO抗凋亡作用的可能機(jī)制，為HBO在臨床治療腦部疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年新西蘭白兔24只，雌雄各半，空腹體質(zhì)量2.0～2.5kg，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組（n＝12）和對照組（n＝12）。實(shí)驗(yàn)組行HBO處理，對照組正常飼養(yǎng)不予任何處理。

1.1.2 主要試劑與儀器（1）主要試劑：組織總RNA提取試劑 RNAiso Plus，PrimeScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑，SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ 熒 光 定 量 PCR 試 劑，兔 β－actin、Caspase－3和Bcl－2基因cDNA引物，上述試劑均由TaKaRa公司提供。（2）主要儀器：PCR 儀（Light Cycler480，瑞士 Roche公司）；山東煙臺冰輪氧艙廠中型高低壓艙（蘭州大學(xué)第一醫(yī)院提供）。

1.2 方法

1.2.1 HBO處理 將實(shí)驗(yàn)組置于特制密閉實(shí)驗(yàn)箱中，箱頂設(shè)供氧管入口和出口，放入HBO艙，實(shí)驗(yàn)前給純氧3～5min洗箱，測得箱內(nèi)氧濃度大于98%為止。采用直排式給氧，100%純氧，約0.01MPa/min勻速加壓15min，壓力2.2ATA，穩(wěn)壓吸氧60min，勻速減壓25min，1次/天，每天進(jìn)出艙時(shí)間固定，連續(xù)3d。

表1 FQ－RT－PCR引物序列

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（FQ－RT－PCR）法檢測 Caspase－3、Bcl－2mRNA的表達(dá)（1）組織取材：HBO處理結(jié)束后1h內(nèi)，對照組和實(shí)驗(yàn)組均給予3%戊巴比妥鈉麻醉，在相對無酶環(huán)境中分離血管，提取頸內(nèi)動(dòng)脈和基底動(dòng)脈，置－80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?）FQ－RT－PCR：采用 TaKaRa公司 RNAiso Plus試劑提取總RNA，并檢測RNA濃度。按照每10μL逆轉(zhuǎn)錄體系500ng總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件：37℃15min，85℃5s，4℃驟冷。以10μL體系擴(kuò)增cDNA，其中SYBR?Premix Ex TaqⅡ（1X）5.0μL，上游引物0.4μL，下游引物0.4μL，cDNA 1μL，dH2O 3.2μL，擴(kuò)增條件：95℃30s；95℃5s，60℃30s，共40個(gè)循環(huán)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，取各次實(shí)驗(yàn)的±s為計(jì)算各基因相對表達(dá)量的CT值。采用2－△△CT法分析數(shù)據(jù)，計(jì)算Caspase－3、Bcl－2mRNA的相對表達(dá)量［2］。計(jì)算公式：改變的倍數(shù)＝2－△△CT，即實(shí)驗(yàn)組目的基因mRNA 的表達(dá)水 平是 對照 組的2－△△CT倍。其中，△△CT＝（實(shí)驗(yàn)組樣本基因均值CT－實(shí)驗(yàn)組β－actin基因均值CT）－（對照組樣本基因均值CT－對照組β－actin基因均值CT）。FQ－RT－PCR引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用±s表示，對Caspase－3、Bcl－2mRNA表達(dá)水平進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兔腦血管內(nèi)皮細(xì)胞目的基因RT－PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線 實(shí)驗(yàn)組和對照組腦血管內(nèi)皮細(xì)胞目的基因的擴(kuò)增曲線包括指數(shù)擴(kuò)增期、線性期及平臺期（圖1）；熔解曲線呈單峰曲線（圖2）。

圖1 目的基因的擴(kuò)增曲線

圖2 目的基因的熔解曲線

表2 兩組Caspase－3和Bcl－2mRNA相對表達(dá)水平的FQ－RT－PCR比較（±s）

表2 兩組Caspase－3和Bcl－2mRNA相對表達(dá)水平的FQ－RT－PCR比較（±s）

a：P＜0.01，與對照組比較。

組別 n ase－3mRNA Bcl－2mRNA對照組 12 1.000±0.225 1.000±0.364 1.000±0.175 1.00頸內(nèi)動(dòng)脈Caspase－3mRNA Bcl－2mRNA基底動(dòng)脈Casp 0±0.117實(shí)驗(yàn)組 12 0.038±0.006a 1.877±0.169a 0.419±0.091a 1.269±0.270a

2.2 兔腦血管內(nèi)皮細(xì)胞 Caspase－3、Bcl－2mRNA 的定量表達(dá)水平 分別以對照組頸內(nèi)動(dòng)脈和基底動(dòng)脈 Caspase－3、Bcl－2 mRNA表達(dá)作為參照。HBO暴露3d后，實(shí)驗(yàn)組頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞促凋亡基因Caspase－3mRNA的表達(dá)明顯降低，抗凋亡基因Bcl－2mRNA的表達(dá)明顯增高；基底動(dòng)脈促凋亡因子Caspase－3mRNA的表達(dá)明顯減少，抗凋亡因子Bcl－2mRNA的表達(dá)明顯升高，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2和圖3。

圖3 HBO對兔頸內(nèi)動(dòng)脈和基底動(dòng)脈Caspase－3、Bcl－2mRNA 的影響

3 討 論

細(xì)胞凋亡是指由基因決定的細(xì)胞程序性死亡，凋亡是可干預(yù)的生理過程［3］。凋亡的最終通路是激活凋亡執(zhí)行因子Caspase－3，通過啟動(dòng)“瀑布式”的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致靶細(xì)胞DNA斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［4］。Bcl－2是目前最重要的凋亡抑制基因，其通過控制細(xì)胞器下游Caspase的活化，發(fā)揮重要的抗凋亡作用［5］。腦細(xì)胞對缺氧尤為敏感，缺氧可導(dǎo)致腦細(xì)胞過度凋亡。近年來的臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，HBO可抑制腦細(xì)胞的凋亡，改善患者的神經(jīng)功能缺損從而發(fā)揮腦保護(hù)作用［6］。為此，本實(shí)驗(yàn)選擇兔腦血管內(nèi)皮細(xì)胞作為研究對象，檢測Caspase－3和Bcl－2 mRNA的表達(dá)水平，旨在發(fā)掘HBO可能的抗凋亡作用機(jī)制。

目前腦損傷后Caspases介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑主要是線粒體途徑。線粒體在凋亡早期的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起主要作用，其中細(xì)胞色素C（Cyt C）的釋放是該路徑啟動(dòng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［7］。腦損傷通過各種途徑改變線粒體的形態(tài)、功能和膜電位，開放線粒體膜的通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔（MPTP），同時(shí)線粒體內(nèi)呼吸鏈解耦聯(lián)，ATP合成減少外膜破裂，使大量Cyt C釋放入細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Cyt C濃度升高而線粒體內(nèi)Cyt C濃度降低，引發(fā)Caspases酶的活化和級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腦循環(huán)細(xì)胞凋亡［8］。Bcl－2的編碼產(chǎn)物通過其C末端疏水性氨基酸片段錨定于線粒體外膜上，通過阻止線粒體膜的滲透性轉(zhuǎn)換（PT）防止線粒體Cyt C的釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡［9］。

本研究結(jié)果顯示，HBO暴露可使頸內(nèi)動(dòng)脈和基底動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞促凋亡因子Caspase－3表達(dá)明顯減少，抗凋亡因子Bcl－2的表達(dá)相對增高，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明HBO暴露可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)因子的表達(dá)水平，延緩和減少腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。其可能機(jī)制是：（1）HBO增加了腦組織的血氧含量，加強(qiáng)了氧的彌散量和腦細(xì)胞對氧和葡萄糖的利用，從而保證腦循環(huán)細(xì)胞的能量代謝，穩(wěn)定了線粒體結(jié)構(gòu)，抑制Cyt C從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)［10］。（2）HBO可減少某些導(dǎo)致線粒體膜通透性、膜電位及結(jié)構(gòu)改變的因子的表達(dá)，使線粒體外膜的穩(wěn)定性得以維持，從而減少Cyt C的釋放。（3）HBO誘導(dǎo)抗凋亡因子Bcl－2的表達(dá)增加，其抑制了線粒體 MPTP的開放，阻止了Cyt C從線粒體的釋放［11］。（4）HBO暴露使促凋亡因子Caspase－3表達(dá)量減少，延緩和減少凋亡級聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)，進(jìn)而抑制凋亡。由此可以看出，上述機(jī)制多是通過抑制Cyt C從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)，從凋亡啟動(dòng)環(huán)節(jié)和最終效應(yīng)部分截?cái)嗔说蛲鲞M(jìn)程的進(jìn)展和凋亡執(zhí)行的發(fā)生，使腦循環(huán)細(xì)胞得以存活。

綜上，HBO對腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡具有抑制作用，這在維持內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡、保證腦血管的正常舒縮功能方面具有一定的保護(hù)性意義，對腦損傷后的臨床恢復(fù)和預(yù)后的改善方面可能是有益的。

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