人MicroRNA335的預(yù)測(cè)靶基因CCL11CCL26及SOX4的鑒定＊

溫志紅，代 艷，何 爽

（廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院：1.兒科；2.康復(fù)科，南寧530021）

微小RNA（MicroRNA）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)度為18～25個(gè)堿基的非編碼單鏈RNA，其在進(jìn)化過(guò)程中高度保守并具有廣泛的生物學(xué)功能。MicroRNA與靶基因3′端非翻譯區(qū)（3′UTR）的堿基完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)，通過(guò)降解信息RNA或抑制翻譯過(guò)程從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［1］。因此，尋找MicroRNA調(diào)控的靶基因，是研究MicroRNA功能的一個(gè)關(guān)鍵切入點(diǎn)。經(jīng)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)嗜酸細(xì)胞趨化因子1（CCL11）、嗜酸細(xì)胞趨化因子3（CCL26）、SOX4是人 MicroRNA335（has－miR－335）的靶基因，本研究將用分子生物學(xué)方法對(duì)3個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 PCR引物（美國(guó)Integrated DNA Technologies公司）；Pre－miRTMmiRNA335Precursor、pMIR－REPORT真核表達(dá)質(zhì)粒（美國(guó)Ambion公司）；PCR試劑盒、T4DNA連接酶試劑盒、大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；限制性核酸內(nèi)切酶（美國(guó)NEB公司）；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒（美國(guó)QIAGEN公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)試劑（美國(guó)Promega公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 PCR儀（美國(guó)Eppendorf公司），二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司），synergyTM 2多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）。

1.2 方法

1.2.1 靶基因預(yù)測(cè) 應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)在線(xiàn)生物信息學(xué)分析軟件mi－Randa和TargetScan，選擇2個(gè)軟件共同預(yù)測(cè)為has－miR－335靶基因且與免疫相關(guān)的CCL11、CCL26、SOX4作為研究對(duì)象。

1.2.2 CCL11、CCL26、SOX4基因3′UTR真核表達(dá)載體的構(gòu)建 CCL11、CCL26基因3′UTR 真核表達(dá)載體 pMIR－REPORT－CCL11 3′UTR、pMIR－REPORT－CCL26 3′UTR已成功構(gòu)建［2］。真核表達(dá)載體pMIR－REPORT－SOX4－3′UTR構(gòu)建方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［2］；擴(kuò)增SOX4基因3′UTR全長(zhǎng)的上游引物5′－GGC CAC TAG TGA AAC GAA AAG GAC A－3′，下游引物5′－GGC CGC CGG CAC ACT GGT GGC AGG T－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物序列長(zhǎng)度1 845bp。

1.2.3 質(zhì)粒提取及純化 Pre－miRTMmiRNA335Precursor、pMIR－REPORT真核表達(dá)質(zhì)粒提取和純化方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［2］。質(zhì)粒經(jīng)美國(guó)辛辛那提兒童醫(yī)學(xué)中心測(cè)序室測(cè)定，序列正確。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇人293T7/17細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種適當(dāng)數(shù)量細(xì)胞于24孔板，37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～72h，待細(xì)胞融合70%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 陰性對(duì)照為空pMIR－REPORT真核表達(dá)載體，陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒自行合成［3］。將真核表達(dá)質(zhì)粒pMIR－REPORT－CCL11 3′UTR、pMIR－REPORT－CCL26 3′UTR、pMIRREPORT－SOX4 3′UTR、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒分別與合成的 PremiRTMmiRNA335Precursor或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染到293T7/17細(xì)胞系，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.6 熒光素酶檢測(cè) 共轉(zhuǎn)染48h后同時(shí)檢測(cè)CCL11、CCL26、SOX4基因3′UTR螢火蟲(chóng)（firefly）和海洋腔腸（renilla）熒光素酶活性，并與陰性對(duì)照對(duì)比，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，操作參照說(shuō)明書(shū)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、制圖，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

由圖所見(jiàn)，hsa－miR－335可顯著降低克隆 SOX4 3′UTR 的報(bào)告基因活性（P＜0.01），表達(dá)下調(diào)30%左右，但并不影響CCL11 3′UTR、CCL26 3′UTR熒光素酶活性。初步認(rèn)為hsamiR－335對(duì)SOX4有靶向調(diào)控作用，而對(duì)CCL11、CCL26并無(wú)此作用，見(jiàn)圖1。

圖1 CCL11、CCL26、SOX4基因相對(duì)熒光素酶活性值

3 討 論

人類(lèi)1/3的基因由 MicroRNA調(diào)控［4］，由此認(rèn)為其在高級(jí)真核生物內(nèi)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用可能和轉(zhuǎn)錄因子一樣重要。MicroRNA通過(guò)降解靶基因mRNA或者轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因表達(dá)而發(fā)揮作用，目前已證實(shí)MicroRNA參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡，生物發(fā)育、脂肪代謝等生命過(guò)程中的一系列重要進(jìn)程，并與免疫系統(tǒng)疾病、心血管疾病、糖尿病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［5－9］。因此，預(yù)測(cè)及驗(yàn)證 MicroRNA靶基因，對(duì)研究MicroRNA的功能及其參與的生物學(xué)過(guò)程具有非常重要意義。

既往研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素13（IL－13）刺激人氣道上皮細(xì)胞，部分MicroRNA表達(dá)上調(diào)，部分 MicroRNA表達(dá)下降，而MicroRNA335是表達(dá)下調(diào)最明顯的一個(gè)。眾所周知，IL－13是參與哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病的重要炎癥介質(zhì)［10］，氣道上皮細(xì)胞參與哮喘氣道炎癥的形成，由此推測(cè)MicroRNA335可能與哮喘等免疫性疾病有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人體試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)MicroRNA確實(shí)參與哮喘氣道炎癥和氣道高反應(yīng)的形成［11－13］。CCL11、CCL26是嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）選擇性化學(xué)趨化劑，通過(guò)與CC家族趨化因子受體3（CCR3）相結(jié)合，吸引EOS向炎癥部位聚集并活化［14］，會(huì)致哮喘患者氣道炎癥加重及氣道高反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)SOX4影響前B細(xì)胞的生存，提示SOX4與免疫相關(guān)［15］。這就是雖然生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè) MicroRNA335的靶基因很多，本研究選擇CCL11、CCL26、SOX4作為研究對(duì)象的原因。

由于一個(gè)MicroRNA可以調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因，一個(gè)靶基因也可以有數(shù)個(gè)MicroRNA與其配對(duì)，給靶基因的預(yù)測(cè)和證實(shí)帶來(lái)了困難［16］。MicroRNA靶基因芯片篩選技術(shù)的應(yīng)用，為疾病的發(fā)病機(jī)制和診斷治療的研究提供了新的思路，但該技術(shù)存在信息質(zhì)量的穩(wěn)定性差、費(fèi)用較高等缺陷限制了它的廣泛應(yīng)用［17］。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè) MicroRNA靶基因，然后通過(guò)分子生物學(xué)方法和技術(shù)加以驗(yàn)證仍然是目前MicroRNA靶基因?qū)ふ业淖畛Ｓ玫膶?shí)驗(yàn)方法［18－19］。當(dāng)前，利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)體外檢測(cè)實(shí)驗(yàn)尋找或驗(yàn)證MicroRNA靶基因已成為不可或缺的一種快速實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

本研究通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件miRanda和TargetScan進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CCL11、CCL26、SOX4可能是hsa－miR－335的靶基因。通過(guò)構(gòu)建報(bào)告基因重組質(zhì)粒pMIR－REPORTCCL11 3′UTR、pMIR－REPORT－CCL26 3′UTR、pMIR－REPORT－SOX4 3′UTR，并分別與Pre－miRTMhsa－miR－335共轉(zhuǎn)染到293T7/17細(xì)胞系；同時(shí)共轉(zhuǎn)染Pre－miRTMmiRNA335Precursor，并設(shè)陰性對(duì)照質(zhì)粒、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒以保證實(shí)驗(yàn)的可靠性。運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定Has－mir－335對(duì)pMIR－REPORT－CCL11 3′UTR、pMIR－REPORT－CCL26 3′UTR、pMIR－REPORT－SOX4 3′UTR的直接作用，通過(guò)觀察熒光素酶的表達(dá)強(qiáng)度初步證實(shí)hsa－miR－335靶向調(diào)控SOX4，但對(duì)CCL11、CCL26并無(wú)影響，提示生物信息學(xué)軟件對(duì)MicroRNA靶基因的預(yù)測(cè)具有假陽(yáng)性，需通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了hsa－miR－335對(duì)靶基因SOX4有良好的可調(diào)控性，為后續(xù)hsa－miR－335與哮喘等免疫性疾病的功能研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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