不同接種途徑和不同接種日齡對(duì)ALV-J感染模式的影響

黃小容，劉廣芹，汪子豪，馮 敏，秦建如，郝建勇，李育豪，曹偉勝，廖 明

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642）

J亞群禽白血病病毒（Subgroup Javian Leukosis virus，ALV-J）最早是由Payne 等于1988 年從肉雞中分離鑒定出的禽白血病/肉瘤病毒群的一個(gè)新的亞群，主要引起肉雞的骨髓細(xì)胞瘤、血管瘤、纖維肉瘤、腎瘤等多種腫瘤。自從我國(guó)于1999 年[1]商品代肉雞中分離到ALV-J以來(lái)，ALV-J的宿主范圍已由肉雞擴(kuò)大到蛋雞[2-3]以及地方品系雞，如麻雞[4]，黃雞[5]和地方柴雞[6]等。ALV-J除了引起腫瘤以外，還會(huì)導(dǎo)致免疫抑制和生產(chǎn)性能降低等表現(xiàn)。ALV-J已給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[7]。

目前防控雞禽白血病主要采用凈化方法[8-9]。評(píng)估ALV-J經(jīng)不同途徑及日齡感染雞后感染模式的變化情況，對(duì)研究ALV-J的致病特點(diǎn)和防控有重要意義。綜合Pandiri 等[10]和孫貝貝等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，ALV-J病毒血癥、抗體及排毒動(dòng)態(tài)與病毒株、感染劑量、途徑及年齡密切相關(guān)。因?yàn)椴煌局甑母腥灸Ｊ街g存在差異性，所以有必要闡明不同流行毒株感染時(shí)這一流行病學(xué)特點(diǎn)。針對(duì)我國(guó)蛋雞群中有血管瘤型ALV-J呈區(qū)域性流行的狀況[12-15]，本研究擬系統(tǒng)性地評(píng)估血管瘤型ALV-J經(jīng)不同接種途徑和日齡接種對(duì)雞感染模式的影響，從而為該病的凈化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和試劑 DF-1細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)ATCC，ALV-J單克隆抗體JE9[16]由揚(yáng)州大學(xué)秦愛(ài)建教授惠贈(zèng)。血管瘤病變型克隆株ALV-JCHN06 株由農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室保存[17]，每0.2 mL感染細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有104.5TCID50病毒。

1.2 隔離器 不銹鋼正/負(fù)壓雞隔離器（GJ-1型），蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 11 日齡SPF 雞胚（白來(lái)航），購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，經(jīng)德州科裕KFK 微電腦全自動(dòng)孵化機(jī)孵化。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別經(jīng)11 日齡雞胚尿囊腔，1 日齡口服、點(diǎn)眼滴鼻、腿部肌肉注射、頸部皮下注射、腹腔注射和7 日齡腹腔注射途徑接種104.5TCID50/0.2 mL的ALV-JCHN06 感染細(xì)胞培養(yǎng)上清液，0.2 mL/只；對(duì)照組為1 日齡SPF 雞經(jīng)腹腔接種0.2 mL DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液。除11日齡雞胚尿囊腔組接種30枚雞胚，出殼后隨機(jī)挑選15 只健雛進(jìn)行試驗(yàn)外，其余各組均接種15 只雞。每只雞帶翅號(hào)，各組雞分別置于不同的隔離器內(nèi)飼養(yǎng)，自由采食和飲水。

1.5 樣品采集和檢測(cè) 各組雞分別于接種后(11 日齡雞胚尿囊腔組于出殼后)第1、2、4、6 周無(wú)菌采集非抗凝血，抗凝血和泄殖腔棉拭子。分離血清，用IDEXX ALV-J抗體ELISA試劑盒檢測(cè)。血漿在DF-1 細(xì)胞上培養(yǎng)和泄殖腔棉拭子經(jīng)凍融處理之后，取上清用IDEXX ALV抗原ELISA試劑盒檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同感染方式下的病毒血癥、抗體和泄殖腔排毒動(dòng)態(tài) 如圖1 所示，11 日齡雞胚尿囊腔組的病毒血癥和泄殖腔p27 抗原陽(yáng)性率均自第4 周開(kāi)始維持在峰值100%（15/15），6 周內(nèi)均未檢測(cè)到ALVJ抗體。1 日齡口服組和點(diǎn)眼滴鼻組各有53.3%（8/15）只雞呈現(xiàn)一過(guò)性病毒血癥，6 周內(nèi)均未檢測(cè)到ALV-J抗體，且第6 周才有6.7%（1/15）泄殖腔p27抗原檢測(cè)為陽(yáng)性。1 日齡頸部皮下注射組、腿部肌肉注射組和腹腔注射組的病毒血癥陽(yáng)性率和泄殖腔p27 抗原陽(yáng)性率均分別在第2 周和第4 周達(dá)到峰值；第4 周時(shí)，1 日齡頸部皮下注射組和腹腔注射組的病毒血癥陽(yáng)性率下降，均為67%(10/15)，而1 日齡腿部肌肉注射組仍維持在峰值，差異顯著（P＜0.05）；第4 周開(kāi)始檢測(cè)到ALV-J抗體，第6 周時(shí)，抗體陽(yáng)性率在33%～47%之間，差異不顯著。7 日齡腹腔注射組的病毒血癥陽(yáng)性率在第2 周達(dá)到峰值67%（10/15）后開(kāi)始降低，第6 周降為0%（0/15），與1 日齡組差異顯著（P＜0.05）。第4 周開(kāi)始檢測(cè)到ALV-J抗體，第6 周時(shí)，抗體陽(yáng)性率高達(dá)93%(14/15)，與1 日齡注射組均差異顯著（P＜0.05）。7 日齡腹腔注射組，泄殖腔p27 抗原陽(yáng)性率一直維持在較低水平13%（2/15），與1 日齡組相比排毒時(shí)間推遲。

2.2 不同接種方式下的感染模式 如表1 所示，11 日齡雞胚尿囊腔組感染模式以V+S+為主，感染雞持續(xù)帶毒排毒。1 日齡口服組和點(diǎn)眼滴鼻組以V-S-感染模式為主。1 日齡注射組第2 周的感染模式以V+S-為主，但1 日齡腿部肌肉注射組有33%（5/15）感染模式為V+S+，部分雞開(kāi)始帶毒排毒；在第4、6 周的感染模式均以V+S+為主。7 日齡腹腔注射組在第2 周67%（10/15）的感染模式為V+S-，而第6 周80%（12/15）的感染模式為V-S-。

圖1 ALV-J經(jīng)不同途徑和不同日齡感染SPF 雞后的病毒血癥、抗體和泄殖腔排毒動(dòng)態(tài)

表1 ALV-J經(jīng)不同接種途徑和不同接種日齡接種SPF 雞后的感染模式

3 討論

不同接種途徑對(duì)ALV-J感染模式影響的結(jié)果顯示：注射途徑比非注射途徑更易誘導(dǎo)病毒血癥和排毒：1 日齡口服組和點(diǎn)眼滴鼻組感染模式以V-S-為主，而1 日齡注射組以V+S+為主。注射途徑中又以1日齡腿部肌肉注射組對(duì)病毒血癥和排毒的影響大。原因可能與不同接種途徑使得到達(dá)靶細(xì)胞的有效病毒量不同有關(guān)。口服和點(diǎn)眼滴鼻組因?yàn)轲つて琳弦约拔傅南饔玫挠绊?，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的有效病毒劑量少，而腿部肌肉等血管豐富的部位，進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)的有效病毒劑量多，且病毒可經(jīng)血液快速在體內(nèi)傳播，病毒血癥和泄殖腔排毒水平提高。

不同感染日齡對(duì)ALV-J感染模式影響的結(jié)果表明，隨著感染日齡的增加，病毒血癥持續(xù)時(shí)間縮短，排毒水平降低，抗體生成水平升高。11 日齡雞胚尿囊腔接種的雞均呈現(xiàn)V+S+的感染模式，這個(gè)結(jié)果與王小芬等[18]用該毒株在麻黃雞上感染的結(jié)果一致，說(shuō)明胚胎感染易導(dǎo)致ALV-J持續(xù)性病毒血癥。相比1 日齡感染組，7 日齡腹腔注射組的病毒血癥呈一過(guò)性，且第6 周的抗體陽(yáng)性率顯著增高。原因可能是隨著年齡的增加，免疫器官的發(fā)育及成熟，雞對(duì)病毒的抵抗力越強(qiáng)。

由本試驗(yàn)得知，ALV-J垂直傳播，感染雞持續(xù)帶毒排毒，是水平感染和先天感染的主要來(lái)源。在早期水平傳播過(guò)程中，ALV-J更容易經(jīng)肌肉注射等注射途徑傳播。

[1]杜巖，崔治中，秦愛(ài)建，等.從市場(chǎng)商品肉雞中檢出J亞群禽白血病病毒[J].中國(guó)家禽，1999，3（1）：1-4.

[2]Xu BR，Dong WX，Yu CM，et al.Occurrence of avian leukosis virus subgroup Jin commercial layer flocks in China[J].Avian Pathol，2004，33（1）：13-17.

[3]辛朝安，曹偉勝，羅開(kāi)健，等.雞血管瘤型白血病診斷初報(bào)[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2006，11：2.

[4]成子強(qiáng)，張利，劉思當(dāng)，等.中國(guó)麻雞中發(fā)現(xiàn)禽J亞群白血病[J].微生物學(xué)報(bào)，2005，45（4）：584-588.

[5]Sun SH，Cui Z Z.Epidemiological and pathological studies of subgroup Javian Leukosis virus infections in Chinese local“yellow”chickens[J].Avian Pathol，2007，36（3）：221-226.

[6]張洪海，劉青，邱波，等.地方柴雞中J亞群禽白血病與馬立克氏病的混合感染[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，40（8）：1215-1221.

[7]Saif Y M.Diseases of Poultry[M].12th edition.Oxford：Blackwell Publishing，2008：514-568.

[8]秦愛(ài)建.禽白血病防控的思考[J].中國(guó)家禽，2011，15（12）：36-37.

[9]崔治中，孫淑紅，趙鵬，等.對(duì)種雞場(chǎng)禽白血病凈化方案的建議[J].中國(guó)家禽，2014，18（01）：3-6.

[10]Pandiri AR，Reed WM，Mays JK，et al.Influence of strain,dose of virus，and age at inoculation on subgroup Javian Leukosis virus persistence,antibody response，and oncogenicity in commercial meattype chickens[J].Avian Dis，2007.51（3）：725-732.

[11]孫貝貝，崔治中，張青嬋，等.ALV-J人工感染雞病毒血癥和抗體反應(yīng)動(dòng)態(tài)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（11）：4069-4076.

[12]徐鑌蕊，董衛(wèi)星，余春明，等.用ALV-Jgp85 單克隆抗體證明蛋雞存在J亞群禽白血病[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36（3）：269-271.

[13]劉玉山，宋敏訓(xùn)，連京華.血管瘤在我省蛋雞群中的發(fā)生及流行[J].家禽科學(xué)，2009（9）：24-25.

[14]羅明星，周碧君，史開(kāi)志，等.血管瘤型禽白血病的實(shí)驗(yàn)室診斷[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2009，28（1）：46-50.

[15]張小桃，賴漢漳，張賀楠，等.血管瘤相關(guān)禽白血病病毒CD08株的分離與鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45（11）：8-10.

[16]Qin AJ，Lee L F，F(xiàn)adly AM，et al.Development and characterization of monoclonal antibodies to subgroup Javian leukosis virus[J].Avian Dis，2001，45（4）：938-945.

[17]Lai H Z，Zhang H N，Ning Z Y，et al.Isolation and characterization of emerging subgroup Javian leukosis virus associated with hemangioma in egg-type chickens[J].Vet Microbiol，2011，151：275-283.

[18]王小芬，劉雪美，廖亞琳，等.J亞型禽白血病病毒感染黃雞病毒血癥和抗體反應(yīng)動(dòng)態(tài)的研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012（08）：174-178.