風(fēng)濕性心臟病患者的CD4+ CD25+ 調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞及細(xì)胞因子的改變及意義

汪蓮開(kāi) (湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院心血管內(nèi)科，恩施 445000)

風(fēng)心病(全稱風(fēng)濕性心臟病，RHD)為自身免疫疾病，是由于急性猩紅熱或風(fēng)濕熱等鏈球菌被感染導(dǎo)致的一種變態(tài)反應(yīng)性的心臟?。?］。在我國(guó)，RHD儼然已經(jīng)嚴(yán)重地威脅到了人民的身體健康。大量研究結(jié)果顯示RHD 體內(nèi)的自身抗體能夠?qū)ρ芷交　⑿募?、心外膜和心?nèi)膜等起反應(yīng)，鏈球菌被感染能激發(fā)患者相應(yīng)的自身免疫性反應(yīng)，引發(fā)病變［2］。本文旨在通過(guò)對(duì)RHD 患者外周血中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素10(IL-10)、白細(xì)胞介素6(IL-6)及CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(CD4+CD25+Treg 細(xì)胞，CD4+CD25+T 細(xì)胞)的檢測(cè)，探討它們的變化和意義，給臨床預(yù)防、診治RHD 提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 分析2012 年4 月至2013 年7 月在我院接受住院治療的RHD 患者的臨床資料。所有RHD 患者均需經(jīng)心臟彩超以及術(shù)后瓣膜檢查的確診，并符合紐約心臟病協(xié)會(huì)制定的心功能Ⅱ～Ⅳ級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。排除腎、肝功能不全者，冠心病患者，炎癥性疾病和急慢性感染患者，惡性腫瘤和腦血管疾病、低氧患者，內(nèi)分泌疾病患者，近期服用相關(guān)調(diào)節(jié)免疫的藥物和出現(xiàn)風(fēng)濕活動(dòng)的患有風(fēng)濕性疾病的患者，其他自身免疫疾病患者等。將所有RHD 患者作為觀察組，共納入40 例患者，其中，男性患者為28 例，女性患者為12 例，患者的平均年齡為(51.4±7.5)歲;而對(duì)照組是從我院的體檢中心選取的健康體檢人員，共納入36 例，其中，男性26 例，女性10 例，平均年齡為(51.3±9.3)歲，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)兩組的性別、年齡差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 研究方法 主要試劑:購(gòu)自美國(guó)Biolegend 公司的APC-Foxp3 抗體(包括配套的破膜液)、PECD25 抗體、FITC-CD4 抗體，購(gòu)自美國(guó)R＆D 公司的人TGF-β1 ELISA 試劑盒與人IL-10ELISA 試劑盒，1640 培養(yǎng)液，2%冰乙酸，0.9%生理鹽水和淋巴細(xì)胞分離液。

主要儀器:購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter 公司的FC 500 型流式細(xì)胞儀，購(gòu)自北京普朗新技術(shù)有限公司的DNX-9620 型自動(dòng)洗板機(jī)，購(gòu)自上海滬西分析儀器有限公司的WH-2 微型渦旋混合儀，恒溫箱，低溫冰箱，EP 管，微量吸管，Tip 頭及吸頭盒，微量加樣管(10～1 000 μl，10～100 μl，2～20 μl)，15 ml的離心管，冷凍管，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，移液管，醫(yī)用冷藏箱，高壓滅菌消毒管，自動(dòng)雙重純水蒸餾器，電動(dòng)離心機(jī)，光學(xué)顯微鏡，RT-2100 型酶標(biāo)儀。

1.2.1 計(jì)算細(xì)胞數(shù)目 采集兩組患者的清晨空腹肘正中靜脈血，共2 管，按測(cè)試要求對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理后，用作細(xì)胞數(shù)目的計(jì)算。在100 μl 的細(xì)胞懸液中添加各20 μl 的PE-CD25 和FITC-CD4 抗體，室溫下進(jìn)行避光反應(yīng)，1/2 h 后離心上述混合液，去除上清液，室溫下滴加破膜液1 000 μl 靜置1/3 h，繼續(xù)添加APC-Foxp3 抗體20 μl，室溫下進(jìn)行避光反應(yīng)，1/2 h 后用染色緩沖液進(jìn)行充分沖洗，離心后采用PBS 溶液(400 μl)使細(xì)胞懸浮，最后以CD4 設(shè)門，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，分析CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞亞群，并計(jì)算CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T 淋巴細(xì)胞百分比。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)TNF-α、TGF-β1、IL-10、IL-6 濃度 室溫下將試劑盒從冰箱中取出靜置1/2 h，將試劑盒緩慢搖勻后打開(kāi)瓶蓋，為使試劑在管底集中而離心各種試劑;標(biāo)準(zhǔn)品在使用前2 h 內(nèi)進(jìn)行稀釋處理，然后分別以100 μl 每孔將樣品依次注入第一排相應(yīng)的酶標(biāo)孔中，蓋上瓶蓋后緩慢晃動(dòng)讓樣品與板底的抗體能充分接觸，3/2 h恒溫處理;配制生物素抗體的工作液，參照之前的加樣的順序以100 μl 每孔依次注入酶標(biāo)孔中，輕輕晃動(dòng)以便板底的抗體和生物素抗體能充分接觸，1 h恒溫處理;再次往酶孔內(nèi)注入ABC(親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物)液，充分接觸后1/2 h 恒溫處理;準(zhǔn)備顯色劑對(duì)樣品實(shí)施顯色反應(yīng)，獲取450 nm處的吸光值，將OD 值測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算TNF-α、TGF-β1、IL-10、IL-6 濃度。

CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞的測(cè)定:首先分離外周血中的PBMCs(單個(gè)核細(xì)胞)，然后將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×106ml-1，最后對(duì)CD4+CD25+Foxp3+Terg 細(xì)胞進(jìn)行染色處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究中的數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)計(jì)量以±s 形式表示，比較采用t 檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。我們定義P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料 本研究共納入受試者76 例，其中觀察組患者40 例(12 例單純二尖瓣狹窄，15 例二尖瓣關(guān)閉不全伴狹窄，13 例二尖瓣、主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全伴狹窄)，對(duì)照組36 例。表1 可見(jiàn)兩組患者的基線資料比較并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2 兩組患者Treg 細(xì)胞比較 觀察組和對(duì)照組的外周血的CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比較詳見(jiàn)表2，結(jié)果可見(jiàn)觀察組患者的CD4+CD25+T 占淋巴細(xì)胞比例(t=17.37，P ＜0.01)、CD4+CD25+Foxp3+Treg 占CD4+T 比例(t=9.224，P ＜0.01)均顯著低于對(duì)照組。

2.3 觀察組與對(duì)照組細(xì)胞因子水平比較 觀察組和對(duì)照組的細(xì)胞因子包括TGF-β1、IL-10、TNF-α、IL-6 水平詳見(jiàn)表3，結(jié)果提示觀察組患者的TGF-β1(t=9.036，P＜0.01)、IL-10(t=12.11，P＜0.01)均顯著低于對(duì)照組，而TNF-α(t=2.331，P=0.013)、IL-6(t=2.239，P＜0.01)水平則高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 觀察組與對(duì)照組基線資料的比較Tab.1 Comparison of general information in observe group and control group

表2 兩組患者CD4+CD25+Treg 細(xì)胞比較Tab.2 Comparison of CD4+CD25+Treg cells in two groups

表3 觀察組和對(duì)照組的炎性因子比較Tab.3 Comparison of inflammatory factors in observe group and control group

3 討論

CD4+CD25+Terg 細(xì)胞(CD4+CD25+T 細(xì)胞，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞)在發(fā)育、功能的發(fā)揮中，受Foxp3(轉(zhuǎn)錄因子)重要的調(diào)控作用，轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+Foxp3+Treg，發(fā)揮CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的前體是Foxp3 組成性的表達(dá)，正常狀態(tài)下機(jī)體內(nèi)自身抗原不與自身反應(yīng)性T 細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)的主要原因是存在的CD4+CD25+Foxp3+Treg 抑制了反應(yīng)性T細(xì)胞的活化。CD4+CD25+Foxp3+Treg 在自身免疫性疾病(如風(fēng)濕性心臟病)中起著重要的作用，對(duì)機(jī)體內(nèi)部分效應(yīng)性T 細(xì)胞和自身反應(yīng)性T 細(xì)胞存在的選擇性抑制是形成、維持調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞免疫自穩(wěn)的一個(gè)重要機(jī)制，其運(yùn)用多種機(jī)制對(duì)自身反應(yīng)性的T細(xì)胞進(jìn)行抑制，保持免疫耐受的狀態(tài)，進(jìn)而達(dá)到免疫自穩(wěn)以及預(yù)防免疫性疾病出現(xiàn)的目的［3］。以往的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Foxp3+Treg 能有效抑制自身免疫性疾病的出現(xiàn)，但是一旦CD4+CD25+Foxp3+Treg 濃度降低，患者的免疫抑制能力則會(huì)隨之減弱，但是此時(shí)體液的免疫功能卻有所增強(qiáng)，活化T細(xì)胞，產(chǎn)生自身抗體，這極易使自身受損進(jìn)而患上自身免疫性的疾病，同時(shí)也會(huì)使致病因子進(jìn)一步擴(kuò)散或持續(xù)存在導(dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)［4］。本研究結(jié)果顯示，RHD 患者體內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+Treg 濃度明顯比健康人低，提示此類患者自身的免疫抑制功能相對(duì)較弱，進(jìn)而導(dǎo)致了如慢性風(fēng)濕性心臟病等一些自身免疫疾病的出現(xiàn)。RHD 患者大部分病史均相對(duì)比較長(zhǎng)，同時(shí)病情反復(fù)，考慮與CD4+CD25+Foxp3+Treg的減少以及致病因子的擴(kuò)散、持續(xù)存在可能相關(guān)［5］。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在抗原濃度降低時(shí)，通過(guò)細(xì)胞接觸來(lái)發(fā)揮作用;在抗原濃度上升時(shí)，通過(guò)分泌TGF-β 和IL-10 等來(lái)發(fā)揮免疫的抑制作用。

IL-10 作為抗炎因子，可以對(duì)單核細(xì)胞促進(jìn)特異性、天然性免疫的功能進(jìn)行有效抑制，主要來(lái)源于Th 細(xì)胞和單核細(xì)胞，只要是淋巴細(xì)胞基本都能合成IL-10［6］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-10 在RHD 患者的血清中的濃度明顯比正常對(duì)照組低，提示在心臟瓣膜出現(xiàn)自身免疫疾病的時(shí)候，由于IL-10 水平的下降，會(huì)致使體內(nèi)自身抗體以及多種炎性因子的合成有所增加且長(zhǎng)期持續(xù)存在，在自身抗體的免疫持續(xù)攻擊中以及炎性因子長(zhǎng)期的局部修復(fù)與受損過(guò)程中，心臟瓣膜逐步開(kāi)始病變，最終導(dǎo)致了心臟瓣膜病的發(fā)生［7］。

TGF-β1 是TGF-β 的主要表現(xiàn)類型，其除了可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)外，還能抑制淋巴細(xì)胞分化、細(xì)胞因子產(chǎn)生以及免疫活性細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1 在RHD 患者外周血清中的濃度明顯比正常對(duì)照組低，提示TGF-β1 濃度出現(xiàn)的變化和心臟瓣膜發(fā)生的病變無(wú)關(guān)，考慮可能是由于心臟瓣膜的局部在出現(xiàn)慢性炎癥時(shí)相應(yīng)的淋巴細(xì)胞開(kāi)始浸潤(rùn)，通過(guò)局部旁TGF-β 的分泌，TGF-β 表達(dá)上升的淋巴細(xì)胞至瓣膜及心肌組織內(nèi)，最終表現(xiàn)為局部的TGF-β 上升同時(shí)引發(fā)了瓣膜鈣化或者纖維化［8］。

通過(guò)TGF-β1 和IL-10，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RHD 患者外周血中不僅CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞水平降低，TGF-β1 和IL-10 的表達(dá)水平也均有所降低。雖然尚無(wú)法確定是CD4+CD25+Foxp3+Treg 細(xì)胞水平的降低導(dǎo)致了TGF-β1 和IL-10 濃度的降低，但是可以肯定它們之間的正比例關(guān)系。故RHD 患者的免疫發(fā)生異常不僅與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞水平的下降有關(guān)，還與TGF-β1 和IL-10 的表達(dá)水平的降低有關(guān)［9］。

TNF-α 和IL-6 均屬于促炎性因子，其中TNF-α是致使機(jī)體對(duì)創(chuàng)傷、手術(shù)做出代謝應(yīng)答的一個(gè)重要的標(biāo)志物，具有使脂蛋白酶活性降低和引發(fā)發(fā)熱的作用;IL-6 具有促進(jìn)急性相蛋白和免疫球蛋白合成、生成前列腺以及β 細(xì)胞增殖的作用。本研究結(jié)果顯示，觀察組患者的TNF-α 和IL-6 濃度明顯比對(duì)照組高，提示RHD 患者體內(nèi)促炎因子增多，RHD 的發(fā)生發(fā)展與TNF-α 和IL-6 濃度有關(guān)，故TNF-α 和IL-6的水平可以作為RHD 病情判斷以及療效的兩項(xiàng)重要的觀察指標(biāo)。總而言之，相比于正常對(duì)照組，RHD 患者外周血中的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞水平有所下降，說(shuō)明RHD 患者病情的發(fā)展受到了發(fā)生紊亂的免疫功能的影響［10］;TGF-β1 和IL-10 水平的變化與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞水平的變化顯著相關(guān)，提示對(duì)RHD 患者，TGF-β1 和IL-10 的水平可以作為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞水平變化的兩項(xiàng)重要的輔助指標(biāo);RHD 患者的TNF-α 和IL-6 濃度明顯比健康者高，說(shuō)明RHD 患者體內(nèi)促炎因子明顯增多，依據(jù)TNF-α 和IL-6 的水平可以判斷RHD 的病情和治療效果。

［1］Remenyi B，Carapetis J，Wyber R，et al.Position statement of the World Heart Federation on the prevention and control of rheumatic heart disease［J］.Nat Rev Cardiol，2013，10(5):284-292.

［2］Shen YC，Yang T，Wan C，et al.Tumor necrosis factor-alpha polymorphisms and rheumatic heart disease risk:a meta-analysis［J］.Int J Cardiol，2013，168(3):2878-2880.

［3］Irlam J，Mayosi BM，Engel M，et al.Primary prevention of acute rheumatic fever and rheumatic heart disease with penicillin in South African children with pharyngitis:a cost-effectiveness analysis［J］.Circ Cardiovasc Qual Outcomes，2013，6 (3):343-351.

［4］Rehman S，Akhtar N，Saba N，et al.A study on the association of TNF-alpha(-308)，IL-6 (-174)，IL-10 (-1082) and IL-1Ra(VNTR)gene polymorphisms with rheumatic heart disease in Pakistani patients［J］.Cytokine，2013，61(2):527-531.

［5］Yakub MA，Dillon J，Krishna MPS，et al.Is rheumatic aetiology a predictor of poor outcome in the current era of mitral valve repair?Contemporary long-term results of mitral valve repair in rheumatic heart disease［J］.Eur J Cardiothorac Surg，2013，44(4):673-681.

［6］Riaz BK，Selim S，Karim MN，et al.Risk factors of rheumatic heart disease in Bangladesh:a case-control study［J］.J Health Popul Nutr，2013，31(1):70-77.

［7］Toor D，Vohra H.Immune responsiveness during disease progression from acute rheumatic fever to chronic rheumatic heart disease［J］.Microbes Infect，2012，14(12):1111-1117.

［8］Guilherme L，F(xiàn)erreira FM，Kohler KF，et al.A vaccine against Streptococcus pyogenes:the potential to prevent rheumatic fever and rheumatic heart disease［J］.Am J Cardiovasc Drugs，2013，13(1):1-4.

［9］Fae KC，Palacios SA，Nogueira LG，et al.CXCL9/Mig mediates T cells recruitment to valvular tissue lesions of chronic rheumatic heart disease patients［J］.Inflammation，2013，36(4):800-811.

［10］Fae KC，Palacios SA，Nogueira LG，et al.CXCL9/Mig mediates T cells recruitment to valvular tissue lesions of chronic rheumatic heart disease patients［J］.Inflammation，2013，36(4):800-811.