人慢性粒細(xì)胞白血病融合蛋白BCR-ABL 適配子篩選及結(jié)構(gòu)分析①

平 娟 趙 娜 申智慧 陰明星 張 倩 張 偉 馬雪姍 陳傳波

(河南大學(xué)淮河臨床學(xué)院，開封 475001)

慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是一種發(fā)生在骨髓和造血干細(xì)胞以粒細(xì)胞增殖為主要特征惡性克隆性疾病，它的特點(diǎn)是產(chǎn)生大量不成熟的白細(xì)胞，這些細(xì)胞在骨髓內(nèi)聚集，抑制骨髓的造血功能，并能夠通過血液在全身擴(kuò)散，導(dǎo)致病人出現(xiàn)貧血、容易出血、感染及器官浸潤等癥狀［1-3］。長期以來，該病一直成為困擾醫(yī)學(xué)工作者的一個難題。因此，探討有效的預(yù)防和治療慢性粒細(xì)胞白血病的新策略和方法是目前慢性粒細(xì)胞白血病研究的關(guān)鍵課題。目前，大部分國內(nèi)外研究證實(shí)，95%的患者骨髓中可以找到Ph染色體，即特征性染色體異位t(9;22)，(q34;q11)及融合基因bcr/abl，融合基因表達(dá)融合蛋白BCRABL，其中BCR-ABL 融合蛋白能激活酪氨酸激酶的活性，和白血病的發(fā)病密切相關(guān)［4，5］。2011 年，國內(nèi)著名學(xué)者王前飛研究員在國際著名雜志《Blood》上發(fā)表了有關(guān)融合蛋白在白血病中致病機(jī)制的最新研究成果，揭示了融合蛋白通過選擇性調(diào)控部分融合蛋白的部分靶基因而推動白血病的發(fā)生，這是目前國內(nèi)首次報道了白血病也和融合蛋白有直接的關(guān)系［6］。

指數(shù)富集配基系統(tǒng)技術(shù)(SELEX)是20 世紀(jì)90年代初期發(fā)展起來的一種研究核酸結(jié)構(gòu)和功能的有效方法，其基本原理是化學(xué)合成一個單鏈核苷酸文庫，庫容量大約1013～1018，常用的初始文庫可以是修飾的或者未修飾的RNA，單鏈DNA(ssDNA)或者雙鏈DNA 文庫，由兩端固定序列及中間30-90 個隨機(jī)堿基構(gòu)成［7］，在理論上每個合適的文庫在適宜條件下都會有一定數(shù)量特定序列和靶分子結(jié)合，將結(jié)合序列和未結(jié)合序列分開以后以PCR 擴(kuò)增得到富集后次級文庫，經(jīng)反復(fù)的結(jié)合、分離、擴(kuò)增等步驟，實(shí)現(xiàn)靶分子特異性結(jié)合序列的指數(shù)級富集［8，9］，基于上述思想，CML 的發(fā)病機(jī)制95%以上和融合蛋白及融合基因有關(guān)，本研究應(yīng)用SELEX 技術(shù)首次進(jìn)行融合蛋白BCR-ABL 適配子(aptamer)篩選，以期達(dá)到對融合蛋白BCR-ABL 的封閉表達(dá)作用，從而起到治療和預(yù)防慢性粒細(xì)胞白血病CML 的目的，為臨床上治療和預(yù)防該疾病提供一個新方向。

1 材料與方法

1.1 材料 BCR-ABL 融合蛋白(為大腸桿bcr-abl菌基因重組蛋白，純度＞95%)，T4DNA 連接酶TaqDNA 聚合酶，T4 多核苷酸激酶，DNA 提取試劑盒，鏈親和素磁珠(promega 公司)，BSA，Hepes(北京華美生物技術(shù)股份有限公司)，異硫氰酸胍(購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，DNA marker(美國sigma 公司)，硝酸纖維素膜(0.60 μm，HAWP，Millipore)，DYY-6C 瓊脂糖凝膠電泳儀(北京六一儀器廠)，DNA 隨機(jī)文庫(由上海生工合成):構(gòu)建長度為90 bp 的隨機(jī)DNA 文庫，兩端為固定序列，中間隨機(jī)序列為44 個堿基，庫容量大約1018，P90 庫:5'-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGF-(N44)-AGTATCGCTAATCAGGCGGAT-3'，上 游 引物:5'-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-3'，下 游引物:5' 端標(biāo)記生物素5'-Biotin-ATCCGCCTGATTAGCGTACT-3'，下游測序引物:5'-TCCGCCTGATTAGCGTACT-3'，5'端標(biāo)記或者不標(biāo)記生物素，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 SELEX 篩選 BCR-ABL 融合蛋白包被于96 孔酶聯(lián)板上，4℃過夜，包被液以0.05 mol/L NaHCO3，pH 為9.2 的緩沖液，同時設(shè)空白對照孔和融合蛋白包被孔，其中空白對照孔以3% BSA 37℃封閉4 h，隨機(jī)ssDNA 文庫與一定量的tRNA 先在結(jié)合緩沖液(SHCMK 液:20 mmol/L Hepes pH7.3，120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2)中經(jīng)與3%BSA 封閉的空白對照組37℃結(jié)合30 min，去除和BSA 結(jié)合的ssDNA，轉(zhuǎn)移到BCR-ABL 融合蛋白孔和融合蛋白結(jié)合40 min，然后用緩沖液(SHCMK 液+吐溫20)洗滌6 次，洗去未結(jié)合的ssDNA，再加洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，4 mmol/L 異硫酸胍，1 mmol/L DTT，pH 8.3)于80℃作用10 min，洗脫下與融合蛋白BCRABL 結(jié)合的ssDNA，經(jīng)酚:氯仿抽提、乙醇沉淀，將ssDNA 溶解于20 μl 的TE 緩沖液中，接著將ssDNA擴(kuò)增成一端帶有生物素的dsDNA，PCR 反應(yīng)體系為:模板5 μl，10 ×PCR 緩沖體系10 μl，MgCl26 μl，dNTPs 100 μmol/L，Taq 酶2 U，上游引物、下游引物5'端各標(biāo)記生物素引物100 pmol/L，加去離子水至100 μl，PCR 反應(yīng)體系為:94℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行24 個循環(huán)94℃變性30 s，60℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，最后72℃延伸7 min，一端帶有生物素的dsDNA 通過生物素-鏈親和素之間的作用與鏈親和素磁珠結(jié)合，經(jīng)結(jié)合緩沖液洗滌3 次后，用0.15 mol/L NaOH 37℃變性15 min，使不帶生物素的一條ssDNA 從鏈親和素磁珠上洗脫下來，經(jīng)無水乙醇沉淀，TE 緩沖液溶解，測定A 值，用作下一輪篩選的ssDNA 文庫，如此反復(fù)進(jìn)行11～15 輪。

1.2.2 文庫與BCR-ABL 融合蛋白結(jié)合率的測定 每輪SELEX 篩選的產(chǎn)物用標(biāo)記生物素的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，PCR 產(chǎn)物用苯酚-氯仿抽提，乙醇沉淀后，測定其吸光度值，取1 μg PCR 產(chǎn)物在100 μl 結(jié)合緩沖液中95℃變性2 min，與等物質(zhì)的量的融合蛋白結(jié)合反應(yīng)30 min，棄上清，用200 μl 緩沖液沖洗融合蛋白-磁珠-ssDNA 復(fù)合物5～7 次，四甲基聯(lián)苯胺顯色，終止后用酶聯(lián)儀測定D450 nm 值，每輪平行測定3 管，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 融合蛋白各步驟SELEX 篩選結(jié)果 以融合蛋白BCR-ABL 為靶標(biāo)，進(jìn)行13 輪篩選，各輪所加融合蛋白，ssDNA 文庫及每輪PCR 擴(kuò)增的最適循環(huán)數(shù)和ssDNA 與融合蛋白的結(jié)合百分率見表1，經(jīng)過13 輪篩選后，分別測定第1、3、6、9、13 輪文庫與融合蛋白的結(jié)合比例，測定結(jié)果顯示:隨著篩選輪數(shù)的增加，第3 輪明顯的提高達(dá)4.5%，第6 輪達(dá)16.3%，第11 輪達(dá)31.0%，第13 輪達(dá)47.1%，繼續(xù)篩選2-5輪后結(jié)合率沒有明顯的提高，見表1、圖1。

2.2 寡核苷酸適配子的克隆、測序及其一級結(jié)構(gòu)分析 第11 輪篩選出ssDNA 適配子群用不帶生物素的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化回收后進(jìn)行克隆，隨機(jī)挑選24 個克隆進(jìn)行序列分析，用5'端標(biāo)記的生物素的引物擴(kuò)增純化后，隨機(jī)分為ABC 三群，各群有8 個克隆子，進(jìn)行適配子和融合蛋白親和性試驗，A 群中的適配子A2、A6、A7 與融合蛋白親和力最強(qiáng)，A 值達(dá)1.42，B 群中B1、B4、B6 與融合蛋白親和力最強(qiáng)，A 值達(dá)1.34，C 群中C3、C5 與融合蛋白BCR-ABL 親和力最強(qiáng)，A 值達(dá)1.33，親和性較好的適配子群結(jié)構(gòu)中含有可以構(gòu)成莖環(huán)或者凸環(huán)結(jié)構(gòu)的序列。見表2，一級序列結(jié)構(gòu)分析表明，所有序列無共同的保守序列，但都含有共同的保守序列TAGTCGGTAA、TGGTCGGTAA、AGGCTGGT 等，這對形成莖環(huán)或凸環(huán)結(jié)構(gòu)有一定意義。見表3。

2.3 寡核苷酸適配子二級結(jié)構(gòu)分析 對所有親和力較高的序列用DNA folding 進(jìn)行最低能量二級結(jié)構(gòu)分析，所有寡核苷酸適配子的二級結(jié)構(gòu)主要可以歸納為以下幾類:5'端和3'端各有一個小莖環(huán)結(jié)構(gòu)，隨機(jī)序列區(qū)域形成一個大的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，3'端與隨機(jī)序列區(qū)形成一個莖環(huán)和凸環(huán)結(jié)構(gòu)，5'端有一個莖環(huán)結(jié)構(gòu)，5'端和3'端分別與隨機(jī)序列形成2～3 個連續(xù)的莖環(huán)序列。結(jié)果顯示，所有二級結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)是莖環(huán)結(jié)構(gòu)或凸環(huán)結(jié)構(gòu)。

表1 各步融合蛋白BCR-ABL 適配體篩選結(jié)果Tab.1 SELEX screening results of each round of BCRABL fusion protein aptamer

圖1 適配子對融合蛋白BCR-ABL 的結(jié)合作用Fig.1 Combination of oligonucleotide to BCR-ABL fusion protein

2.4 寡核苷酸適配子與BCR-ABL 融合蛋白Kd值測定 結(jié)構(gòu)根據(jù)一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，測定8 個寡核苷酸適配子和融合蛋白的親和力，通過Sctachard 作圖分析測定寡核苷酸適配子的Kd 值，適配子A2、A6、A7、B1、B4、B6、C3、C5 與融合蛋白BCR-ABL 的親和力分別為72、89、120、210、230、360、430、890 nmo/L。由于親和力和Kd 值成反比，所以Kd 值越小，親和力越高，因此適配子A2 與融合蛋白BCR-ABL 的親和力最高，達(dá)72 nmo/L。

表2 適配子對融合蛋白BCR-ABL 的親和性Tab.2 Affinities of aptamers binding to BCR-ABL fusion protein

表3 A2，A6，A7，B1，B4，B6，C3，C5 適配子群測序結(jié)果Tab.3 Sequences of aptamers of A2，A6，A7，B1，B4，B6，C3，C5

3 討論

融合蛋白BCR-ABL 是融合基因bcr-abl 編碼的一種具有酪氨酸激酶活性的蛋白，并呈現(xiàn)不同的表型，是CML 發(fā)病的基礎(chǔ)［10］，白血病基因異位后產(chǎn)生的融合蛋白是白血病特有的分子標(biāo)記，融合前期各蛋白均在血細(xì)胞正常代謝或者分化中起一定的作用，異位融合蛋白所形成的融合蛋白具有促進(jìn)增殖和分化作用，白細(xì)胞的一些轉(zhuǎn)錄因子在融合前，對血系干細(xì)胞分化為正常白細(xì)胞有重要作用，在異位融合發(fā)生后，所形成的異位融合蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子融合蛋白多具有促進(jìn)增殖和抑制分化作用［11，12］，融合蛋白從生物學(xué)角度來講主要有兩類:一類是具有酪氨酸激酶作用的異位融合蛋白如BCR-ABL、TELPDGFR、NPM-ALK、LYN 等異位融合蛋白，另一類是具有抑制造血轉(zhuǎn)錄調(diào)控的異位融合蛋白即血液特異性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)融合蛋白，如AML/MTG8、TEL/AML 等，大量的研究表明針對酪氨酸激酶作用的融合蛋白干擾可顯著降低白血病細(xì)胞的增殖，對白血病特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子融合蛋白干擾可降低白血病細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其分化，由于靶向白血病特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子融合蛋白不僅可以抑制白細(xì)胞的增殖，而且還能促進(jìn)其分化，因此針對轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子融合蛋白靶向研究越來越受重視［13，14］，本文利用SELEX 技術(shù)來篩選慢性粒細(xì)胞白血病融合蛋白BCRABL 適體，以期篩選出來的高親和性寡核苷酸片段能夠特異性的封閉融合蛋白BCR-ABL 的表達(dá)，達(dá)到治療和預(yù)防慢性粒細(xì)胞白血病的目的，為臨床上治療該疾病提供一個新的研究方向。

［1］朱 磊，郭靜明.慢性粒細(xì)胞白血病的治療進(jìn)展［J］.航空航天醫(yī)藥，2010，21(8):1378-1385.

［2］魏 慧.慢性粒細(xì)胞白血病的診斷和治療進(jìn)展［J］.長江大學(xué)學(xué)報，2011，8(8):225-231.

［3］干定云，陳 燕.慢性粒細(xì)胞白血病分子靶向治療的新進(jìn)展［J］.臨床血液學(xué)雜志，2006，19(3):190-192

［4］胡增祥，張伯龍，劉 莉，等.急性淋巴細(xì)胞白血病bcr-abl 融合基因表達(dá)的臨床研究［J］.華北國防醫(yī)藥，2002，14(1):19-24.

［5］沈 君，王開泰，陸紅娟 慢性粒細(xì)胞白血病的診斷與治療［J］.中國實(shí)用內(nèi)科學(xué)雜志，2008，28(1):203-206.

［6］Wang QF.MLL fusion proteins preferentially regulate a subset of wild-type MLL target genes in the leukemic genome［J］.Blood，2011，117(25):6895-6905.

［7］CAO XX，LI SH，CHENG LC.Combining use of a panel of ssDNA aptamer in the detection of staphylococcus aureus［J］.Nucleic acids research，2009，37(14):4621-4628.

［8］張朝陽，郭 磊，李一林.SELEX 與適配體在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用［J］.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2008，5(1):50-54.

［9］邵寧生，李少華，黃燕平.SELEX 技術(shù)及aptamer 研究新進(jìn)展［J］.生物化學(xué)與生物物理研究進(jìn)展，2006，33(4):329-335.

［10］楊崇禮，馮寶章.BCR-ABL 融合蛋白多樣性及其與白血病的表型關(guān)系［J］.中國實(shí)驗血液學(xué)雜志，1998，6(3):168-172.

［11］張之南，沈 悌.血液病診斷及其治療標(biāo)準(zhǔn)［M］.北京:北京科學(xué)技術(shù)出版社，2002:168-194.

［12］Saussels S，Lauseker M，Gratwohl A，et al.allogenetic hematopoietic stem cell transplantation for chronic myeloid leukemia in the imatinib era:evaluation of its impact with in a sub group of randomized German CML study IV ［J］.Blood，2010，115:1880-1885.

［13］Deiniger M W，Goldman J M，Melo J V，et al.the molecular biology of chronic myeloid leukemia［J］.Blood，2010，96 (3):343-356.

［14］Branford S，Melo J V，Hughes T P.Selecting optimal second-line tyrosine kinase inhibitor therapy for chronic myeloid leukemia patients after imatinib failure:does the BCR-ABL mutation status really matter［J］.Blood，2009，114:5426-5435.