激活素A 對小鼠中性粒細胞活性的調控作用①

齊 妍 崔雪玲 閆 青 吳 倩 柳忠輝 葛敬巖 (吉林大學基礎醫(yī)學院免疫系，長春 130021)

中性粒細胞是血液循環(huán)中數量最多的白細胞，是機體防御細菌和真菌等病原體重要的固有免疫細胞，具有吞噬、遷移及呼吸爆發(fā)等細胞功能［1］。活化的中性粒細胞可以通過呼吸爆發(fā)產生大量超氧陰離子及活性氧(Reactive oxygen species，ROS)造成微生物的損傷和死亡［2，3］。中性粒細胞還參與多種炎癥相關性疾病的發(fā)生發(fā)展，近幾年通過調控中性粒細胞來減少炎癥反應對機體損傷的相關研究逐漸增多。激活素A(Activin A)屬于轉化生長因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)超家族的多功能免疫調節(jié)因子，激活素A 異常表達與炎性疾病密切相關［4］，已知多種免疫細胞可產生激活素A，包括單核巨噬細胞、肥大細胞及Th2 細胞等［5-7］。最近研究表明中性粒細胞也是激活素A 的主要來源細胞之一，炎癥活化中性粒細胞及巨噬細胞均可快速釋放大量的激活素A［8］，激活素A 又以自分泌/旁分泌形式調控巨噬細胞功能，但激活素A 能否以自分泌/旁分泌形式調控中性粒細胞活性，以及調控中性粒細胞的信號傳導機制，仍無確切報道。因此，本研究擬通過檢測中性粒細胞激活素受體表達(ActR)以及中性粒細胞活性，闡述激活素A 調控中性粒細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6 小鼠，雄性，8～10 周，由吉林大學動物中心提供。

1.2 主要試劑 激活素A 購自R＆D 公司;Percoll購自GE Healthcare 公司;PE 標記Anti-Gr-1 購自ebioscience 公司;APC 標記Anti-ActRⅡA 購自R＆D公司;超氧化物檢測試劑盒及活性氧檢測試劑盒購自碧云天公司。

1.3 分離中性粒細胞 每只小鼠腹腔注射9%酪蛋白1 ml，第一次注射后24 h 重復注射一次同等劑量的酪蛋白，第二次注射后3 h 收集小鼠腹腔積液細胞。將收集好的細胞用冷PBS 洗滌3 次后，用含10%小牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基重懸，轉移至50 ml 培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2 h 后，收集懸浮細胞。將收集好的細胞(5 ×107ml-1)與100% Percoll 以1∶9的比例在超速離心管中混合，將混合液4℃，190 000 r/min 離心65 min，棄掉含有巨噬細胞和淋巴細胞的第一層液體，收集第二層液體中的細胞。將收集好的細胞用迪夫快速染色試劑染色觀察，并用流式細胞術檢測Gr-1+細胞，此方法分離的中性粒細胞純度大于90%。

1.4 免疫熒光細胞化學染色檢測ActRⅡA 及Gr-1表達 使用免疫熒光細胞化學染色檢測中性粒細胞激活素ⅡA 型受體(ActRⅡA)表達。將分離后的中性粒細胞用冷FACS 液洗滌細胞2 次，加入兔抗ActRⅡA(1∶500)，4℃孵育過夜，冷FACS 液洗滌細胞2 次，加入FITC 標記Anti-Rabbit-IgG、PE 標記Anti-Mouse-Gr-1 及DAPI，4℃避光孵育30 min，FACS 液洗滌2 次，熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。同型對照組加入兔IgG 代替兔抗ActRⅡA，PE 標記IgG 代替PE 標記Anti-Mouse-Gr-1 進行孵育。

1.5 流式細胞術檢測Gr-1 及ActRⅡA 表達 使用流式細胞術檢測Gr-1 及ActRⅡA 表達。將分離后的中性粒細胞用冷FACS 液洗滌細胞2 次，加入100 μl 冷的FACS 液重懸，分別加入APC 標記Anti-Mouse-ActRⅡA 及PE 標記Anti-Mouse-Gr-1，4℃避光孵育30 min，FACS 液洗滌2 次，300 μl FACS 液重懸細胞，流式細胞儀進行檢測，同型對照組加入APC 標記Mouse-IgG 及PE 標記Mouse-IgG。

1.6 Western blot 檢測激活素A 刺激后Smad3 表達 將分離好的中性粒細胞(3 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內孵育30 min。收集細胞，分別加入蛋白裂解液［1% Triton X-100，500 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L PMSF，4 μg/ml leupeptin，1 μg/ml aprotinin］，充分裂解后，離心取上清。蛋白通過SDS-PAGE 分離后，轉印至聚偏氟乙烯膜(PVDF)上，分別加入兔抗ActR ⅡA 抗體(1 ∶1 000)，兔抗Smad3 抗體(1 ∶500)，兔抗磷酸化Smad3(p-Smad3)抗體(1∶500)及兔抗GAPDH 抗體(1∶1 000)孵育，洗滌3 次后，加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG 孵育，最后加入ECL 試劑(ECLPlus;Amersham Pharmacia Biotech)，通過化學發(fā)光成像檢測目的蛋白。

1.7 檢測激活素A 刺激后中性粒細胞內ROS 水平 利用熒光探針DCFH-DA 進行細胞內活性氧(Reactive oxygen species，ROS)檢測，DCFH-DA 本身無熒光，可被細胞內酯酶水解生成DCFH，ROS 可將無熒光的DCFH 氧化生成有熒光的DCF，最后通過測定熒光強度從而檢測細胞內ROS 水平。將分離好的中性粒細胞(1 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12 h。去除細胞培養(yǎng)液，加入DCFH-DA，37℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。使用熒光酶標儀檢測熒光強度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.8 檢測激活素A 刺激后O2-的產生 O2-的檢測使用超氧化物檢測試劑盒(分解水溶性四唑鹽，WST-1)。將分離好的中性粒細胞(1 ×106)加激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12 h。去除細胞培養(yǎng)液，加入含有WST-1 的反應液，37℃避光孵育5 min，使用酶標儀在450 nm測定吸光度值A。

1.9 檢測激活素A 刺激后NO 分泌水平 將分離好的中性粒細胞(1 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12 h。收集上清，Griess 法檢測NO，將上清液與Griess 試劑［0.1% N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽，1%對氨基苯磺酸和2.5%磷酸］等體積混合，室溫孵育5 min。使用酶標儀在540 nm 測定吸光度值A。雙蒸水稀釋的亞硝酸鹽作為標準品，濃度從1～100 mmol/L。

1.10 激活素A 刺激后中性粒細胞吞噬活性 將分離好的中性粒細胞(3 ×106)加入激活素A(0～10 ng/ml)，37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)12 h。加紅色熒光微球(Microspheres，Red Fluoresent)，37℃孵育1 h 后洗去未被吞噬的紅色熒光微球，收集細胞，流式細胞術檢測吞噬百分率。

2 結果

2.1 分離小鼠腹腔中性粒細胞 迪夫快速染色結果顯示用此方法得到的中性粒細胞純度＞90%(圖1A)，對分離后的細胞用PE 標記抗鼠Gr-1 與FITC標記抗鼠CD3 抗體雙染，結果顯示Gr-1+細胞占細胞總數＞99%(圖1B)。

2.2 中性粒細胞表達ActRⅡA 免疫熒光染色結果顯示中性粒細胞可以同時表達Gr-1 與ActRⅡA(圖2A)，流式細胞術檢測結果顯示中性粒細胞中Gr-1 與ActRⅡA 雙陽性細胞為41.14%(圖2B)。

圖1 小鼠腹腔中性粒細胞的分離Fig.1 Isolation of peritoneal neutrophils in mouse

圖2 ActRⅡA 在中性粒細胞的表達Fig.2 Expression of ActRⅡA on mouse neutrophils

圖3 激活素A 對中性粒細胞激活素信號蛋白Smad3 表達的影響Fig.3 Effects of activin A on expression of Smad3 in mouse neutrophils

2.3 激活素A 對中性粒細胞激活素信號蛋白Smad3 表達的影響 如圖3 所示，激活素A 刺激后，中性粒細胞p-Smad3 表達上調，Smad3 蛋白表達有所下降，該結果進一步表明，激活素A 可以作用于中性粒細胞并導致激活素信號傳導通路的活化。

圖4 激活素A 對中性粒細胞呼吸爆發(fā)的影響Fig.4 Effects of activin A on respiratory burst

圖5 激活素A 對中性粒細胞NO 分泌及吞噬作用的影響Fig.5 Up-regulation of activin A on production of NO and phagocytosis of mouse neutrophils

2.4 激活素A 對中性粒細胞呼吸爆發(fā)的影響 結果顯示，激活素A 可以增加中性粒細胞內ROS(圖4A)及細胞外O2-的產生(圖4B)，該結果提示激活素A 可能通過激活中性粒細胞，增加中性粒細胞的耗氧量，產生呼吸爆發(fā)，提供中性粒細胞抗感染作用。

2.5 激活素A 促進中性粒細胞NO 分泌及吞噬能力 如圖5 所示，不同濃度的激活素A 均可以促進中性粒細胞產生NO，流式細胞術檢測結果顯示激活素A 可以明顯促進中性粒細胞對紅色熒光微球的吞噬。

3 討論

激活素A 是重要的免疫調節(jié)因子，可由多種免疫細胞產生，并對多種免疫細胞功能具有調節(jié)作用，最近有研究顯示TNF-α 可以通過p38 MAPK 信號通路刺激中性粒細胞分泌大量激活素A［8］，然而，這些由中性粒細胞分泌的激活素A 是否可以作用于中性粒細胞目前尚不明確。激活素受體屬于絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶型受體，分為激活素Ⅰ型受體(AcRⅠ)及激活素Ⅱ型受體(ActRⅡ)。激活素首先與ActRⅡ結合形成復合體，導致ActRⅡ變構，激活ActRⅠ，進而引發(fā)細胞內信號蛋白Smad 家族的級聯反應，將信號傳導入細胞核內［9］。Smad 蛋白家族中的Smad2、3 可以介導TGF-β 和激活素的信號傳遞，磷酸化Smad3 對激活素信號傳導具有極其重要的作用［10，11］。本研究通過免疫熒光細胞化學染色以及流式細胞術檢測結果顯示，中性粒細胞標志物Gr-1 和ActRⅡA 可以共表達于中性粒細胞表面，而且激活素A 刺激中性粒細胞后可以上調激活素信號傳導蛋白Smad3 磷酸化，上述資料充分證明，中性粒細胞不僅可以產生激活素A，同時也是激活素A 作用的靶細胞，激活素A 可能通過自分泌/旁分泌形式調控中性粒細胞活性。

激活素A 在一些主要由中性粒細胞參與的疾病中表達升高［12，13］，然而激活素A 是否可以調節(jié)中性粒細胞活性，目前仍無確切證據。我們的研究結果表明，激活素A 對中性粒細胞多種功能均有調節(jié)作用。呼吸爆發(fā)是中性粒細胞發(fā)揮其功能的重要機制，激活素A 可以增加中性粒細胞內ROS 及細胞外O2-的產生，使中性粒細胞產生呼吸爆發(fā)。此外，激活素A 還具有刺激中性粒細胞分泌NO，增強中性粒細胞的吞噬作用。

綜上所述，本研究證明激活素A 可以直接作用于中性粒細胞，并調節(jié)中性粒細胞多種功能，在中性粒細胞介導的炎癥應答中可能具有重要意義。

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