TAZ基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)

仲念念,朱伶俐,王 旋,房 娜

(1.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河南開(kāi)封475004;2.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京210046)

TAZ基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)

仲念念1,朱伶俐2,王 旋1,房 娜1

(1.河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河南開(kāi)封475004;2.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京210046)

摘 要:目的構(gòu)建重組質(zhì)粒TAZ-pcDNA3.1及TAZ-p EGFP-C2,并應(yīng)用Western Blot檢測(cè)TAZ蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況,初步探索TAZ分子促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的作用機(jī)制。方法通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得TAZ基因片段,膠回收后連接T載體,藍(lán)白斑篩選,轉(zhuǎn)化,提質(zhì)粒,酶切,用T4 DNA Ligase連接,亞克隆進(jìn)入pEGFP-C2和pcDNA3.1獲得新的重組質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,智能型熒光細(xì)胞監(jiān)測(cè)儀觀察TAZ分子在細(xì)胞內(nèi)的分布情況,Western Blot檢測(cè)其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序證明構(gòu)建成功,熒光照片顯示TAZ分子分布在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中,Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染有重組質(zhì)粒TAZ-pcDNA3.1的HEK293細(xì)胞中有大量TAZ蛋白表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建了兩種重組質(zhì)粒,并初步驗(yàn)證了TAZ蛋白的細(xì)胞定位,為進(jìn)一步研究其促進(jìn)增殖和遷移的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:TAZ基因;重組質(zhì)粒;HEK293細(xì)胞

Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡中具有重要作用,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系[1]。TAZ分子是轉(zhuǎn)錄共激活因子,是Hippo信號(hào)通路中的一個(gè)靶點(diǎn),作為14-3-3蛋白的結(jié)合蛋白發(fā)揮作用,因?yàn)樗兄鳺W結(jié)構(gòu)域,也被稱(chēng)為WWTR1[2]。在癌細(xì)胞中,TAZ分子的表達(dá)量很高,如人乳腺癌細(xì)胞系、胃癌細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌等,其過(guò)表達(dá)引起的形態(tài)學(xué)改變細(xì)胞轉(zhuǎn)化的特性,促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[3]。TAZ分子在不同的細(xì)胞中的分布不同,有的分布在細(xì)胞漿中如原發(fā)性乳腺導(dǎo)管癌細(xì)胞,有的分布在細(xì)胞核中如骨轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞[4-5]。因此,明確TAZ蛋白的亞細(xì)胞定位有助于闡明其促進(jìn)增殖和遷移的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了重組質(zhì)粒TAZ-p EGFP-C2及TAZ-pcDNA3.1,并初步檢測(cè)了TAZ蛋白的表達(dá)情況和細(xì)胞定位,為進(jìn)一步闡明TAZ蛋白促進(jìn)增殖和遷移的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、質(zhì)粒載體和菌株

HEK293細(xì)胞由河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與免疫實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);含TAZ基因的質(zhì)粒PET28a-TAZ(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);質(zhì)粒pcDNA3.1和p EGFP-C2以及感受態(tài)大腸桿菌TOP10為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑與儀器

內(nèi)切酶EcoRⅠ、Bam HⅠ、T4 DNA Ligase、LA Taq聚合酶、T載體連接試劑盒(日本Ta KaRa公司);質(zhì)粒提取試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、DNA Marker(上海萊楓生物科技有限公司);Lipo2000(美國(guó)Invitrogen公司);兔抗人TAZ多抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司);PCR擴(kuò)增儀、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司);WD-9413B紫外凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠);Ju LI智能型熒光細(xì)胞監(jiān)測(cè)儀(韓國(guó)NanoEn Tek公司)。

1.3引物設(shè)計(jì)與PCR產(chǎn)物擴(kuò)增

根據(jù)GeneBank中TAZ的基因序列(Gene ID: 25937)設(shè)計(jì)引物:T1:5'-GAATTCATGAATCCGGCCTCGGCGCCCC-3',5'端引入ECORⅠ酶切位點(diǎn); T2:5'-GGATCCTTACAGCCAGGTTAGAAAGGGC-3', 5'端引入Bam HⅠ酶切位點(diǎn)。引物由蘇州金唯智生物工程公司合成。以質(zhì)粒PET28a-TAZ為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得目的片段。PCR的反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5 min;30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增:94℃(45 s),58℃(45 s),72℃(90 s);循環(huán)結(jié)束后,72℃延伸5 min,16℃降溫10 min。取PCR反應(yīng)液5μL,10 g/ L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4構(gòu)建重組質(zhì)粒

將目的片段與T載體16℃水循環(huán)連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)TOP10細(xì)胞,鋪板,藍(lán)白篩選,挑取白色單克隆菌落,37℃搖菌過(guò)夜,提質(zhì)粒,用EcoRⅠ和Bam HⅠ酶切鑒定,并送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的TAZ-T載體質(zhì)粒和質(zhì)粒pc DNA3.1及p EGFP-C2分別用EcoRⅠ和Bam HⅠ酶切,電泳,膠回收目的片段。將回收的TAZ片段分別和回收的pcDNA3.1及p EGFP-C2酶切片段16℃水循環(huán)連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化,挑陽(yáng)性克隆,搖菌,提質(zhì)粒并用Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切鑒定,將鑒定正確的重組質(zhì)粒―20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.5觀察TAZ分子細(xì)胞定位

參考轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,用Lipo2000將新鮮提取的重組質(zhì)粒TAZ-p EGFP-C2轉(zhuǎn)入70%融合的HEK293細(xì)胞中,培養(yǎng)36 h后用熒光細(xì)胞監(jiān)測(cè)儀觀察重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率及TAZ分子在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。

1.6檢測(cè)TAZ蛋白表達(dá)水平

用轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000分別將新鮮提取的重組質(zhì)粒TAZ-pcDNA3.1和質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)入80%融合的HEK293細(xì)胞中,并設(shè)置無(wú)轉(zhuǎn)染試劑的空白對(duì)照和只加入轉(zhuǎn)染試劑的陰性對(duì)照。培養(yǎng)48 h后分別收集細(xì)胞,提蛋白,體積分?jǐn)?shù)為10%SDS-PAGE電泳, PVDF膜轉(zhuǎn)印,用50 g/L的奶粉按1∶750的比例稀釋TAZ抗體,4℃搖床孵育過(guò)夜。按1∶10 000的比例稀釋二抗(羊抗兔抗體),室溫孵育1 h,在膜上滴ECL發(fā)光液,暗室中壓片曝光。

2　結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳可觀察到在1 000 bp和2 000 bp之間有特異性條帶,大小與TAZ基因相符(1 400 bp),見(jiàn)圖1。

2.2重組質(zhì)粒酶切鑒定

TAZ連接T載體經(jīng)藍(lán)白篩選,挑取白色單克隆菌落搖菌后送去測(cè)序,測(cè)序結(jié)果正確。TAZ-p EGFPC2和TAZ-pcDNA3.1酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果為兩條帶,一條帶約為1 400 bp,一條約為5 000 bp,符合預(yù)期結(jié)果。見(jiàn)圖2。由此結(jié)果表明重組質(zhì)粒TAZ-p EGFP-C2和TAZ-pcDNA3.1構(gòu)建成功。

2.3TAZ分子細(xì)胞定位觀察

重組質(zhì)粒TAZ-p EGFP-C2轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48 h后,用熒光細(xì)胞監(jiān)測(cè)儀觀察綠色熒光。TAZ蛋白彌散分布于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中,細(xì)胞核中更為集中。見(jiàn)圖3。

2.4TAZ分子蛋白表達(dá)水平

Western Blot檢測(cè)TAZ表達(dá)情況結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4中可以看出TAZ抗體檢測(cè)結(jié)果為轉(zhuǎn)染TAZ-pc DNA3.1的細(xì)胞蛋白表達(dá)量明顯多于轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)量。

3　討論

Hippo信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,其調(diào)控作用失調(diào)時(shí)就會(huì)引起癌癥的發(fā)生,而TAZ分子是此通路中一個(gè)重要調(diào)控靶點(diǎn),其促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制需要進(jìn)一步探究[6]。

TAZ是一個(gè)轉(zhuǎn)錄共激活因子,進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄因子活性促進(jìn)基因表達(dá)[2]。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)TAZ的亞細(xì)胞定位是研究TAZ分子促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移機(jī)制的一個(gè)重要的實(shí)驗(yàn)手段。我們的實(shí)驗(yàn)所采用的p EGFP-C2載體,其加強(qiáng)型的GFP標(biāo)記在所表達(dá)蛋白的N端,這樣即可以方便檢測(cè)帶有EGFP標(biāo)簽的目的蛋白,與轉(zhuǎn)染細(xì)胞自身表達(dá)或誘導(dǎo)表達(dá)的TAZ蛋白進(jìn)行區(qū)別,而且不需要處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞,可以直接在熒光顯微鏡下觀察標(biāo)簽蛋白的亞細(xì)胞定位。

我們成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒TAZ-p EGFP-C2和TAZ-pcDNA3.1。在今后的研究中,運(yùn)用該真核表達(dá)質(zhì)粒不僅可以直接采用熒光顯微鏡探討影響TAZ亞細(xì)胞定位的因素,也能用Western Blot法檢測(cè)TAZ的蛋白表達(dá)水平,為探討TAZ分子促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)材料。

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[3]Guo L,Teng L.YAP/TAZ for cancer therapy:Opportunities and challenges(Review)[J].Int J Oncol,2015,46 (4):1 444―1 452.

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[責(zé)任編輯姬 荷]

[1]Fernandez L A,Kenney A M.The Hippo in the room:a

Construction and expression of recombinant plasmid TAZ-pcDNA3.1 and TAZ-pEGFP-C2

ZHONG Niannian1，ZHU Lingli2，WANG Xuan1，F(xiàn)ANG Na1
（1.Medical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2.College of Life Science of Nanjing University，Nanjing 210046，China）

Abstract：ObjectiveTwo recombinant plasmids，TAZ-pcDNA3.1 and TAZ-p EGFP-C2，were established.The protein expression of TAZ in HEK293 cells was detected by Western Blot and the roles of TAZ in promoting cell proliferation and migration were further explored.MethodsAZ gene was amplified by PCR，fragments were recovered followed by connection with glue T carrier，blue-white screening，transformation and extraction of plasmid DNA.Then the plasmid DNA was digested，connected by T4 DNA Ligase，and then sub-cloned into p EGFP-C2 and pcDNA3.1 to construct new recombinant plasmids.These plasmids were transfected into HEK293 cells to observe the distribution of TAZ using a fluorescence detector.The protein expression was detected by Western Blot.ResultsBy restriction enzyme identification and sequence analysis，the recombinant plasmids were successfully constructed.Fluorescent photos show that the distribution of TAZ molecule was in the nucleus and cytoplasm.Western Blot test results showed that TAZ molecule could induce over-expression of specific proteins.ConclusionTwo recombinant plasmids were successfully constructed.The effects of TAZ over-expression were validated，which will lay a foundation for revealing the mechanism of TAZ in promoting cell proliferation and migration.

Key words：TAZ gene；The recombinant plasmid；HEK293 cells

作者簡(jiǎn)介:仲念念(1995―),男,河南駐馬店人,在校本科生,從事基礎(chǔ)及口腔醫(yī)學(xué)的學(xué)習(xí)與研究工作。

基金項(xiàng)目:河南大學(xué)校內(nèi)科研基金(2011YBZR007)。

收稿日期:2015-03-01

中圖分類(lèi)號(hào):Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1672―7606(2015)02―0111―04