糖尿病合并腦缺血大鼠模型對(duì)炎癥因子的影響

呂 靖,宋軍營(yíng),賈亞泉,陳顏嫣,張振強(qiáng)

(河南中醫(yī)學(xué)院,河南鄭州450008)

糖尿病合并腦缺血大鼠模型對(duì)炎癥因子的影響

呂 靖,宋軍營(yíng),賈亞泉,陳顏嫣,張振強(qiáng)*

(河南中醫(yī)學(xué)院,河南鄭州450008)

摘 要:目的比較炎癥因子在單純性腦缺血和復(fù)合性腦缺血不同時(shí)間點(diǎn)的變化,分析糖尿病炎癥因素對(duì)腦缺血的影響。方法通過(guò)復(fù)制大腦中動(dòng)脈缺血模型,觀察大鼠腦部缺血的損傷情況;采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)血清中的腫瘤壞死因子a(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)的含量。結(jié)果TNF-α、IL-1、COX-2在糖尿病組中的水平均高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.05;與正常組相比單純腦缺血組模型在3、7 d中呈高表達(dá)趨勢(shì),差異性明顯,P＜0.05;復(fù)合腦缺血組與糖尿病組比較,表達(dá)均降低,差異性顯著,P＜0.05。復(fù)合腦缺血組與單純腦缺血組比較,TNF-α、IL-1 3 d時(shí)組間比較降低、COX-2升高,7 d時(shí)組間比較均降低,差異性明顯,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.05。結(jié)論在糖尿病狀態(tài)下,炎癥因子在缺血不同時(shí)期既有累積現(xiàn)象,又有特異性的表達(dá),與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞:糖尿病;腦缺血;糖尿病模型;糖尿病復(fù)合腦缺血模型;炎癥因子

腦缺血和糖尿病均為臨床上的常見病、多發(fā)病。腦缺血具有高死亡率、高致殘率的特點(diǎn),其中超過(guò)30%的缺血患者被診斷有糖尿病基礎(chǔ)病變[1]。已有研究[2]表明,糖尿病是發(fā)生卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一,同時(shí),糖尿病患者發(fā)生腦缺血的危險(xiǎn)性是非糖尿病患者的2～4倍。糖尿病導(dǎo)致腦血管損傷的病理基礎(chǔ)是動(dòng)脈粥樣硬化。炎癥因子引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能受損是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的起始環(huán)節(jié)[3],近年來(lái),糖尿病還被認(rèn)為是一種慢性低度炎癥性疾病。炎癥反應(yīng)與腦缺血的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),主要涉及腦水腫的發(fā)生、血腦屏障的破壞、炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、細(xì)胞因子黏附分子的表達(dá)等[4]。但其主要機(jī)制尚不明確。我們從炎癥因子對(duì)單純性腦缺血和糖尿病合并腦缺血的影響進(jìn)行研究,旨在探討炎癥因子在糖尿病復(fù)合腦缺血中的作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠,8周齡,體質(zhì)量(180±10)g,由北京通利實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2主要儀器與試劑 酶標(biāo)儀(1510型,Thermo公司);洗板機(jī)(888型,Thermo公司);電子天平(FA/JA-B型,上海精密科學(xué)儀器有限公司)。鏈脲佐菌素(Sigma公司,批號(hào):20140215);檸檬酸(批號(hào): 20090306),檸檬酸鈉(批號(hào):20070403),購(gòu)自濟(jì)寧佰一化工有限公司;腫瘤壞死因子a(TNF-α)、白介素-1 (IL-1)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)試劑盒(南京建成)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病組。正常對(duì)照組四組為正常組、假手術(shù)組、單純腦缺血3 d和7 d組;糖尿病組四組為糖尿病組,糖尿病假手術(shù)組,糖尿病復(fù)合腦缺血3 d和7 d組。建立腦缺血模型組為15只(按成模率70%計(jì),保證造模成功后取材的動(dòng)物數(shù)),其余均為10只。其中正常對(duì)照組以清潔級(jí)正常飼料喂養(yǎng),糖尿病組以清潔級(jí)正常飼料加葡萄糖水喂養(yǎng)。

1.2.2模型制作 糖尿病模型制備:取SD大鼠正常喂養(yǎng)一周后,禁食不禁水12 h后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(溶于0.1 mmo L/L枸櫞酸緩沖液) 55 mg/kg,72 h后取鼠尾血測(cè)血糖,超過(guò)16.7 mmol/L以上為糖尿病大鼠。模型制備成功后,繼續(xù)飼養(yǎng)4周后備用。腦缺血模型建立:糖尿病模型制備成功4周后,將正常組與糖尿病組根據(jù)Longa[5]報(bào)道的線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型加以改進(jìn)。常規(guī)麻醉后固定大鼠,頸前皮膚消毒,頸部正中切口,鈍性分離皮下組織,暴露左側(cè)頸動(dòng)脈三角,逐層分離組織,暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。結(jié)扎ECA、CCA,并穿線于ICA,用中號(hào)動(dòng)脈夾夾閉ICA。用眼科剪將CCA剪一小切口,由此迅速插入漁線(漁線的選擇根據(jù)動(dòng)物的重量而定,一般250 g以下的動(dòng)物選擇0.234 mm的漁線,250～300 g的動(dòng)物選擇0.261 mm的漁線,300 g以上的動(dòng)物選擇0.28 mm的漁線,頭端蘸指甲油),輕推漁線使之由頸總動(dòng)脈通過(guò)分叉部進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈,至大腦中動(dòng)脈的起點(diǎn)。插入深度約18～22 mm,使其阻斷大腦中動(dòng)脈的血液供應(yīng),在傷口處撒上頭孢曲松鈉粉,縫合頸部切口。假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程與模型組相同,分離出左側(cè)的CCA、ECA、ICA,但僅結(jié)扎ECA(每只造模時(shí)間不超過(guò)15 min)。待動(dòng)物蘇醒后進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。根據(jù)評(píng)分結(jié)果進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3行為功能的觀察與評(píng)分 在造模大鼠完全蘇醒后和取材前分別進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。參照Longa的5級(jí)評(píng)分方法評(píng)定動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)功能。0級(jí):無(wú)體征;1級(jí):動(dòng)物左側(cè)前肢不能完全伸展;2級(jí):左前肢癱瘓,出現(xiàn)追尾現(xiàn)象;3級(jí):肢體癱瘓,不能站立;4級(jí):動(dòng)物昏迷,無(wú)自主性活動(dòng)。評(píng)分是1級(jí)到3級(jí)的動(dòng)物視為造模成功,入組,于實(shí)驗(yàn)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行再次評(píng)分后取材。計(jì)算方法:以各組動(dòng)物造模蘇醒時(shí)、取材前兩次評(píng)分進(jìn)行組間比較。

1.2.4血清采集 動(dòng)物模型制備成功后于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)(3 d和7 d)取材,以及正常組和假手術(shù)組各取5只動(dòng)物,體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛(0.3 m L/100 g)腹腔注射麻醉后腹主動(dòng)脈取血5 m L,靜置30 min后,以3 000 r/min離心15 min,取上清液,―20℃冰箱保存。

1.2.5用酶聯(lián)免疫方法(ELISA)檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1、COX-2的含量,依照試劑盒說(shuō)明書步驟依次進(jìn)行操作。

1.2.6統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)用(ˉx±s)來(lái)表示,多組之間的比較采用單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間的比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1正常大鼠與糖尿病大鼠的血糖對(duì)比

與正常組大鼠相比,糖尿病組大鼠的血糖水平明顯高于正常組,其差異性顯著(P＜0.01)。見表1。

2.2各組神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果

各組模型在蘇醒后和取材前的功能評(píng)分進(jìn)行比較,各組之間差異性不明顯(P＞0.05);對(duì)單純腦缺血組與復(fù)合腦缺血組在造模蘇醒后和3 d、7 d取材前的功能評(píng)分進(jìn)行比較,3 d組組間差異性不顯著(P＞0.05),復(fù)合腦缺血7 d組組間比較差值較大,差異性顯著(P＜0.05)。見表2。

表2　各組模大鼠蘇醒后和取材前神經(jīng)功能評(píng)分的差異±s,n=5)

注:單純腦缺血組與復(fù)合腦缺血組在造模蘇醒后和3、7 d取材前的功能評(píng)分相比較,*P＜0.05)。

組別蘇醒后評(píng)分取材前評(píng)分差值正常假手術(shù)組0 0 0單純腦缺血3 d組2.0±0.71 1.8±0.45 0.2±1.10單純腦缺血7 d組1.8±0.45 1.6±0.55 0.2±0.84糖尿病假手術(shù)組0 0 0復(fù)合腦缺血3 d組2.0±0.71 2.2±0.45―0.2±0.84復(fù)合腦缺血7 d組2.0±0.55 2.6±0.55―0.6±0.55*

2.3各組血清中炎癥因子的含量

與正常及正常假手術(shù)組相比,單純腦缺血3、7 d組和糖尿病及糖尿病假手術(shù)組的血清中TNF-α、IL-1、COX-2的含量顯著增加(P＜0.05);復(fù)合腦缺血3 d和7 d組TNF-α的含量明顯降低(P＜0.05); IL-1的含量3 d組降低不明顯(P＞0.05),7 d組的含量顯著降低(P＜0.05);COX-2的含量顯著增加(P＜0.05)。

與單純腦缺血3 d及單純腦缺血7 d組相比,單純腦缺血7 d和糖尿病及其假手術(shù)組血清中TNF-α的含量有下降趨勢(shì),IL-1、COX-2的含量增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);復(fù)合腦缺血3 d和7 d組血清中TNF-α、IL-1的含量降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);COX-2的含量降低不明顯(P＞0.05)。

與糖尿病及其假手術(shù)組相比,單純腦缺血3 d和7 d組TNF-α的含量增加,但無(wú)顯著性差異(P＞0.05),IL-1、COX-2的含量降低明顯(P＜0.05);復(fù)合腦缺血3 d和7 d組血清中TNF-α、IL-1、COX-2的含量降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

與復(fù)合腦缺血3 d組相比,復(fù)合腦缺血7 d組血清中TNF-α、IL-1、COX-2的含量都明顯降低(P＜0.05)。見表3。

3　討論

胰島素抵抗和高血糖導(dǎo)致心血管疾病的機(jī)制仍不完善,但所有的機(jī)制都聚集在血管壁和內(nèi)皮上,內(nèi)皮細(xì)胞在血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[6]。糖尿病導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂和血管壁損傷均涉及炎癥反應(yīng)。近年來(lái)的研究表明,糖尿病患者具有較高水平的炎癥標(biāo)記物,多種炎癥因子與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。臨床上糖尿病并發(fā)腦缺血的患者癥狀較一般腦梗死患者嚴(yán)重,損傷性更大,因此,如何有效預(yù)防糖尿病并發(fā)腦缺血,需要進(jìn)一步的研究。

TNF-α和IL-1是兩個(gè)重要的致炎因子,一般這些因子在腦缺血發(fā)生后,促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),導(dǎo)致水腫形成,從而參與腦損傷的過(guò)程,在發(fā)生腦缺血后TNF-α和IL-1β的活性明顯升高[7-8]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果單純腦缺血組與之一致。單純腦缺血發(fā)作后血清中TNF-α和IL-1的活性升高,促進(jìn)了炎癥反應(yīng),參與腦損傷的過(guò)程[9]。糖尿病條件下其活性也明顯增高,血糖增高介導(dǎo)了炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,導(dǎo)致炎癥因子增高[10]。但在復(fù)合缺血的情況下,其活性明顯降低,甚至低于正常組。在糖尿病、單純腦缺血和復(fù)合腦缺血狀態(tài)下,血清中COX-2的活性均增高,在單純腦缺血3 d、7 d時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)上升趨勢(shì),在復(fù)合腦缺血組的時(shí)間點(diǎn)則是下降趨勢(shì)。高血糖可引起NF-kB的轉(zhuǎn)錄和激活[11],在腦缺血損傷時(shí)也可激活NF-k B,活化的NF-kB促使COX-2啟動(dòng)子的活性增強(qiáng),誘導(dǎo)COX-2等炎性介質(zhì)的表達(dá)[9]。魏巍等[12]觀察到患者患病初期TNF-α水平明顯高于正常對(duì)照組,2周后水平逐漸降低。說(shuō)明炎癥因子在缺血不同時(shí)期和不同狀態(tài)下既有累積現(xiàn)象,又有特異性的表達(dá),炎癥反應(yīng)雖可造成組織損傷,但是炎癥本身卻是用來(lái)修復(fù)缺乏免疫的組織的。在糖尿病復(fù)合腦缺血的狀態(tài)下,炎癥因子的特異性表達(dá),是否是由于炎癥因子在長(zhǎng)期低度炎癥狀態(tài)下發(fā)生損傷修復(fù)的雙重作用,還需要我們進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

炎癥反應(yīng)是腦缺血發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素之一,它們的表達(dá)水平與疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。因此對(duì)炎癥因子在何種階段和時(shí)期呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),何種因素阻斷炎癥因子的表達(dá),都需要進(jìn)一步的研究,以探討炎癥因子在腦缺血損傷中的作用機(jī)制。

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[責(zé)任編輯 姬 荷]

Diabetic merger of cerebral ischemia in rat models of inflammation factor influence

LV Jing，SONG Junying，JIA Yaquan，CHEN Yanyan，ZHANG zhenqiang*
（Henan college of traditional Chinese medicine，zhengzhou，Henan 450008，China）

Abstract：ObjectiveBy comparing inflammation change in different time change between the cerebral ischemia model and diabetic merger of cerebral ischemmodel of rats.MethodsConstructing middle cerebral artery occlusion model，and observe the brain ischemia injury of rat.Detect the concentration of TNF-α、IL-1 and COX-2 in serum between groups by ELISA.ResultsThe concentration of TNF-α、IL-1 and COX-2 in the diabetic group were higher than normal group（P＜0.05）.The cerebral ischemia rats compared with normal rats in 3 days and 7 days showed high expression，and showed significant differences（P＜0.05）.Compared to diabetic group，in diabetic concurrent cerebral ischemia group，the concentration of them were lower with significant difference in 3 days and in 7 days after ischemia（P＜0.05）.Compared to the cerebral ischemia group and the diabetic concurrent cerebral ischemia group，the concentration of TNF-α、IL-1 were lower in 3 days after ischemia，at the same time，the concentration of COX-2 showed high expression.and they were in decreased in 7 days after ischemia（P＜0.05）.ConclusionUnder the condition of diabetic，the inflammatory factors has not only accumulated phenomenon，but also specific expression in the difference of cerebral ischemia period，So closely associated with the development of the disease.Key words：diabetes；cerebral ischemia；diabetes model；he diabetic concurrent cerebral ischemia group；inflammation factor

*通訊作者:張振強(qiáng)(1971―),男,河南伊川人,博士,教授,從事中西醫(yī)結(jié)合防治腦病基礎(chǔ)與臨床研究工作。

基金項(xiàng)目:河南省高?？萍紕?chuàng)新人才支持計(jì)劃(13HASTIT027);河南中醫(yī)學(xué)院“博士科研基金”項(xiàng)目(BSJJ2012-13)。

作者簡(jiǎn)介:呂靖(1988―),女,河南西峽人,碩士研究生,從事中西醫(yī)結(jié)合防治腦病的基礎(chǔ)和臨床研究工作。

收稿日期:2015-03-12

中圖分類號(hào):R589.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1672―7606(2015)02―0107―04