SIRT7基因乙酰化活性缺失突變真核表達載體的構(gòu)建

李小娜,梁慧敏,王天曉,韓 飛,劉文斌,鄭立娟,董 嚴(yán),劉晉祎,時小燕*

(1.河南大學(xué)中藥研究所,河南開封475004;2.河南大學(xué)淮河醫(yī)院,河南開封475000;3.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院軍事毒理學(xué)研究所,重慶400038;4.甘肅省人民醫(yī)院,甘肅蘭州730000)

SIRT7基因乙?；钚匀笔蛔冋婧吮磉_載體的構(gòu)建

李小娜1,3,梁慧敏2,王天曉1,韓 飛3,劉文斌3,鄭立娟4,董 嚴(yán)3,劉晉祎3,時小燕1,3*

(1.河南大學(xué)中藥研究所,河南開封475004;2.河南大學(xué)淮河醫(yī)院,河南開封475000;3.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院軍事毒理學(xué)研究所,重慶400038;4.甘肅省人民醫(yī)院,甘肅蘭州730000)

摘 要:目的構(gòu)建SIRT7基因乙?；钚匀笔У亩c突變真核表達載體。方法用RT-PCR法從293T細(xì)胞中擴增SIRT7基因,并克隆到真核載體pcDNA 3.1/myc-His(―)A上。采用Two-step PCR定點突變技術(shù),構(gòu)建SIRT7基因的H187Y突變質(zhì)粒,經(jīng)測序確證定點突變成功,再將SIRT7及突變載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,Western blot檢測融合蛋白表達。結(jié)果克隆出SIRT7基因,構(gòu)建了真核載體pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7,經(jīng)Two-step PCR獲得突變體pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7H187Y。DNA測序結(jié)果表明,編碼187位氨基酸的560～562位堿基由CAC突變?yōu)門AC,其他堿基均無突變。SIRT7和H187Y突變載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,可檢測出myc-SIRT7融合蛋白表達。結(jié)論成功構(gòu)建了SIRT7以及H187Y突變的真核表達載體。

關(guān)鍵詞:SIRT7;Two-step PCR;定點突變;真核表達載體

Sirtuins為哺乳動物第Ⅲ類組蛋白去乙?；讣易?共包括7個成員SIRT1-SIRT7。Sirtuins成員在細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)及基因沉默等方面發(fā)揮重要作用[1-2]。目前,關(guān)于SIRT7的生物學(xué)功能研究較少。與該家族中其他成員相似,它亦具有NAD+依賴的去乙?；富钚?并且其生物學(xué)功能的發(fā)揮也主要是通過其去乙?；富钚詠韺崿F(xiàn)的。SIRT7基因為一單拷貝基因,由10個外顯子組成,在基因組上定位于17q25.3。SIRT7與異染色體區(qū)和核仁相結(jié)合,主要定位于核仁,少部分存在于胞漿和線粒體[3-4]。SIRT7可能參與調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期以及腫瘤發(fā)生。由于SIRT7自身復(fù)雜性和對細(xì)胞環(huán)境依賴性,關(guān)于SIRT7生物學(xué)功能目前存在爭論[5-7]。生物信息學(xué)分析表明,SIRT7基因內(nèi)高度保守的NAD+依賴的催化中心區(qū)域位于第107～278氨基酸殘基之間。有文獻報道,SIRT7第187位組氨酸(H)突變?yōu)槔野彼?Y)后,其去乙?；富钚越档?。結(jié)合上述生物信息學(xué)分析及已有的研究,為更好地深入研究SIRT7的功能,我們首先克隆出SIRT7基因并利用Two-step PCR構(gòu)建了SIRT7 H187Y位點突變基因的真核表達載體,用以進一步研究SIRT7的生物學(xué)功能。

1　材料與方法

1.1主要試劑和材料

M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、Oligo(d T)15、Trizol試劑和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Invitrogene公司產(chǎn)品);限制性內(nèi)切酶XhoI、EcoRI、T4 DNA連接酶(NEB公司產(chǎn)品);2×Pfu Master Mix、DNA凝膠回收試劑盒(北京康為世紀(jì)生物公司產(chǎn)品);PCR產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒純化試劑盒(美國promega公司產(chǎn)品);myc小鼠單克隆抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品);Easy-See Western Blot檢測試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司);大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技北京公司);PCR引物合成及測序由上海英駿公司完成;真核載體pcDNA 3.1/myc-His(―)A為北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院3所1室錢露博士惠贈;293T細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫物保藏中心。

1.2人SIRT7基因全長的克隆

用Trizol試劑從培養(yǎng)人293T細(xì)胞中提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。根據(jù)GenBank中提供的SIRT7序列(NM_ 016538.2),用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計擴增SIRT7全長基因的上游引物: F:5’-AGACTCGAGCGATGGCAGCCGGGGGTCT GA-3’,引入酶切位點XhoI(下劃線部分);下游引物R:5’-GTGGAATTCTCGTCACTTTCTTCCTTTT TGTGCGT-3’,引入酶切位點Eco RI(下劃線部分)。

以cDNA第一鏈為模板,用上述特異引物進行PCR擴增。循環(huán)參數(shù)為:95℃,5 min,95℃,45 s, 53℃,1 min,72℃,1 min,共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物純化后與pcDNA 3.1/myc-His(―)A載體分別用XhoI和EcoRI雙酶切并純化,T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α菌。在含氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)后挑取單菌落,搖菌后提質(zhì)粒,進行雙酶切鑒定,酶切正確的陽性重組質(zhì)粒送上海英駿公司測序。序列正確者記為pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7。

1.3兩步法PCR定點突變

PCR擴增突變片段:合成4條引物,其中2條(F,R)位于兩端,用于擴增SIRT7全長片段,另外2條(M1,M2)含有突變位點并且部分序列互補。引物序列如下:

F:5’-AGACTCGAGCGATGGCAGCCGGGGGTCT GA-3’,引入酶切位點XhoI(下劃線部分);R:5’-GTGGAATTCTCGTCACTTTCTTCCTTTTTGT GCGT-3’,引入酶切位點Eco RI(下劃線部分)。M1:5’-CATCTCCGAGCTCTACGGGAACATGTACAT-3’,(下劃線為突變位點T);M2:5’-ATG TACATGTTCCCGTAGAGCTCGGAGATG-3’(下劃線為突變位點A)。

各引物在PCR擴增片段上的位置,見圖1。

以正常重組質(zhì)粒pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7為模板,分別F/M2和M1/R為引物進行PCR擴增,切膠回收兩個片段。再以F/R為引物,將以上兩個片段的純化物同時加入作為模板,進行PCR擴增。將得到的片段純化后與pcDNA 3.1/myc-His(―)A載體分別用XhoI和Eco RI雙酶切并純化,T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α菌。在含氨芐青霉素的LB平板上培養(yǎng)后挑取單菌落,搖菌后提質(zhì)粒,進行雙酶切鑒定,酶切正確的陽性重組質(zhì)粒送上海英駿公司測序。序列正確者記為pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7 H 187Y。

2　結(jié)果

2.1人SIRT7基因全長的克隆

以293T細(xì)胞的總RNA為模板,經(jīng)RT-PCR擴增。1%瓊脂糖凝膠電泳后顯示出一條約1 203 bp大小的DNA片段,見圖2。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后,成功克隆至pc DNA 3.1/myc-His載體。重組質(zhì)粒經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切得到約5 500 bp和1 203 bp的片段,與預(yù)期結(jié)果一致,見圖3。測序結(jié)果顯示,插入片段長度為1 203 bp,與NCBI已公布的人類SIRT7核酸序列(NM-016538.2)一致。

2.2兩步法PCR定點突變結(jié)果

引物M1和M2攜帶突變位點,并且部分重疊互補。分別以F/M2和M1/R為引物,重組質(zhì)粒pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7為模板,擴增出的兩個突變片段,由于中間有一段序列互補,故可以在PCR退火過程中配對連接形成長的片段。再以此長片段為模板,F/R為引物PCR時,得到1 203bp片段,見圖4。通過酶切與連接將該突變片段插入到pcDNA 3.1/ myc-His載體中,經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切篩選出陽性克隆pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7H187Y,見圖5。測序結(jié)果證實,已將突變點引入,第559位密碼子由CAC突變?yōu)門AC,其他堿基均未發(fā)生改變。部分測序結(jié)果,見圖6。

3　討論

SIRT7作為第Ⅲ類組蛋白去乙?；讣易宄蓡T之一,目前,對其生物學(xué)功能研究較少。少量研究[8-9]提示,SIRT7可能參與調(diào)控RNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期以及腫瘤發(fā)生。由于SIRT7基因本身功能的復(fù)雜性, SIRT7在腫瘤形成過程中充當(dāng)癌基因還是抑癌基因,目前尚無定論。

有報道發(fā)現(xiàn),SIRT7蛋白催化中心區(qū)域內(nèi)的H187Y突變,將導(dǎo)致其NAD+依賴的去乙?；富钚越档?進而影響SRIT7的生物學(xué)功能。鑒于此,我們?yōu)樯钊胩接慡IRT7基因的生物學(xué)功能,本研究首先從293T細(xì)胞中成功克隆出SIRT7基因,并利用Two-step PCR定點突變技術(shù)構(gòu)建了含SIRT7H187Y突變體真核表達載體。

我們首先設(shè)計了含突變位點堿基的引物,通過兩步法PCR,使兩個重疊片段可在隨后的延伸反應(yīng)中融合,然后利用全長引物通過PCR將SIRT7 H187Y突變體全長擴增出來。突變產(chǎn)物序列分析結(jié)果表明,目的基因引入了預(yù)期位點的突變,而其他位點堿基無一發(fā)生突變。總之,本研究成功克隆得到SIRT7基因全長編碼序列及其H187Y突變體,為進一步研究SIRT7基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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[5]Voelter-Mahlknecht S,Letzel S,Mahlknecht U.Fluorescence in situ hybridization and chromosomal organization of the human Sirtuin 7 gene[J].Int J Oncol,2006,28 (4):899―908.

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[責(zé)任編輯時 紅]

The construction of eukaryotic expression vectors for SIRT7 gene with acetylation activity deletion

LI Xiaona1，3，LIANG Huimin2，WANG Tianxiao1，HAN Fei3，LIU Wenbin3，ZHENG Lijuan4，DONG Yan3，LIU Jinyi3，SHI Xiaoyan1，3＊
（1.Institute of Chinese material medicine，Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2.Huaihe Clinical College of Henan University，Kaifeng.Henan 475000，China；3.Institute of Toxicology，College of Preventive Medicine，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China；4.Gansu province people hospital，Lanzhou，Gansu 730000，China）

Abstract：ObjectiveTo construct eukaryotic expression vectors for SIRT7 gene with acetylation activity deletion induced by site directed mutagenesis.MethodsSIRT7 gene was amplified by RT-PCR from 293T cells and cloned into the eukaryotic vector pcDNA 3.1/myc-His（-）A.Site directed mutagenesis method based on two-step PCR was performed to construct dominant negative（DN）mutants H187Y.The point mutation was verified by DNA sequencing.The mammalian 293T cell was transfected with SIRT7 and the mutants.The expression of the fused proteins was determined by Western blot.ResultsSIRT7 gene was cloned and the eukaryotic vector pcDNA 3.1/ myc-His-SIRT7 was constructed.The mutants were obtained by two-step PCR.DNA sequencing showed that CAC at 560―562 bps sites，which encoded the 187 amino acids，was changed to TAC.No mutation was found in other base pair sites of the recombinant plasmids.The fusion protein myc-SIRT7 was detectable by Western blot in 293T cells transfected with the mutant vectors.ConclusionThe eukaryotic expression vectors for SIRT7 and its mutantsbook=12,ebook=17H187Y were successfully constructed.

Key words：SIRT7；Two-step PCR；site directed mutagenesis；eukaryotic expression vector

*通訊作者:時小燕(1975―),女,河南靈寶人,博士,副教授,從事腫瘤分子機制的研究工作。

基金項目:中國博士后科學(xué)基金(2013M542496);河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點項目(13A310094)。

作者簡介:李小娜(1987―),女,河南安陽人,碩士研究生,從事腫瘤分子機制的研究工作。

收稿日期:2015-02-12

中圖分類號:R730.2

文獻標(biāo)識碼:A

文章編號:1672―7606(2015)02―0087―04