滅釘螺微生物的篩選及功效研究

崔國(guó)艷，汪世平，程紅兵，何 鑫，閭丘思嘉，黃成銘

滅釘螺微生物的篩選及功效研究

崔國(guó)艷1,2，汪世平1，程紅兵2，何 鑫1，閭丘思嘉1，黃成銘1

目的 消滅釘螺是防治血吸蟲(chóng)病重要工作，篩選出一種高效、低毒、持久及價(jià)廉的殺螺細(xì)菌是有意義的探索。方法 本文從釘螺孳生的土壤中篩選出具有殺螺作用的強(qiáng)毒菌株，分別制備成細(xì)菌發(fā)酵液、發(fā)酵上清液和菌體懸液進(jìn)行浸泡殺螺比較，取得了初步結(jié)果。結(jié)果 經(jīng)初篩，分離出4株(B8、B27、B36、B59)對(duì)釘螺具有毒性作用的細(xì)菌；滅螺實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，4株細(xì)菌的發(fā)酵液、發(fā)酵上清液和菌體懸液均顯示出不同的毒殺作用，綜合比較發(fā)現(xiàn)，B59菌株的滅螺效果最好，其次是B27、B36菌株，B8菌株最弱。在細(xì)菌發(fā)酵上清液各菌株間滅螺效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.286，P=0.002)；各菌株發(fā)酵液的滅螺效果差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.298，P=0.008)；但各菌株菌體懸液之間的滅螺效果未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=7.579，P=0.271)。結(jié)論 細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，尤以B59菌株的發(fā)酵上清液有較好的滅螺功效。

血吸蟲(chóng)??；釘螺；微生物；滅螺效果；死亡率

血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的人獸共患寄生蟲(chóng)病，主要流行于發(fā)展中國(guó)家，每年約207萬(wàn)人感染日本血吸蟲(chóng)，將近800萬(wàn)人受感染的威脅，且感染人數(shù)在發(fā)展中國(guó)家仍呈上升態(tài)勢(shì)[1-2]。我國(guó)是日本血吸蟲(chóng)病流行最為嚴(yán)重的國(guó)家，約1億人受血吸蟲(chóng)病的威脅[3]。釘螺是日本血吸蟲(chóng)的唯一中間宿主，是造成日本血吸蟲(chóng)病流行的重要根源。目前滅螺的方法主要有3類(lèi)，物理滅螺工程浩大，費(fèi)事費(fèi)力，滅螺效果慢，且適用范圍相對(duì)較少；化學(xué)藥物滅螺存在選擇性弱、持久性差、價(jià)格高、易污染環(huán)境且需反復(fù)滅螺等問(wèn)題[4-5]；生物滅螺環(huán)保、低廉，通過(guò)改變釘螺的孳生環(huán)境或者使用天敵，打破原有的種群平衡，環(huán)境保護(hù)意義重大[6]。微生物滅螺對(duì)非靶生物無(wú)毒性、高效、穩(wěn)定，對(duì)釘螺有定向特異性。相比其它生物而言，微生物及其代謝產(chǎn)物具有更多的生物多樣性、生長(zhǎng)周期短、可誘導(dǎo)產(chǎn)物產(chǎn)生等特點(diǎn)[7]，是生物滅螺中較有前景的研究方向。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者從疫區(qū)釘螺孳生地篩選出一批滅螺微生物，但由于對(duì)其殺螺活性成份、如何致毒等問(wèn)題尚不明確，因此實(shí)際應(yīng)用效果并不理想[8-12]。所以在環(huán)保問(wèn)題日益嚴(yán)峻的今天，尋找一種對(duì)人畜、農(nóng)作物及水生物無(wú)害的、對(duì)釘螺殺傷力強(qiáng)的微生物迫在眉睫。本研究擬從釘螺孳生地的土壤中篩選出一批對(duì)釘螺具有毒殺作用的微生物，為尋找理想的滅螺微生物及其代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源 從湖南省汨羅市血吸蟲(chóng)病防治研究現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)基地釘螺池中采集土壤樣本15份，毒性試驗(yàn)釘螺亦采自實(shí)驗(yàn)基地同一生態(tài)螺池中的野外釘螺,在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，挑選7-8旋活力強(qiáng)的成螺。

1.2 樣本處理 每份土壤樣本取細(xì)土10 g于三角瓶中，加入90 mL無(wú)菌蒸餾水中，搖床振蕩30 min混勻，制成懸液備用。

1.3 分離培養(yǎng) 取制備的土壤懸液各1 mL，采用梯度稀釋法稀釋至10-5、10-6，取 0.2 mL涂布于LB平板上(2個(gè)平行)，30 ℃培養(yǎng)3～4 d觀察培養(yǎng)細(xì)菌菌落形態(tài)。分離的菌株經(jīng)3次純化后，移至LB斜面培養(yǎng)基上，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 初篩 將上述得到的純菌株轉(zhuǎn)至LB液體培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)48 h后，分別配制成1%菌液浸泡釘螺24～48 h，篩選出對(duì)釘螺致死率>50%的菌株。20%甘油保種，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)菌成分的制備 將初篩得到的各純菌株轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)液中，30 ℃振蕩培養(yǎng)72 h，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并調(diào)整各初篩菌株的濃度為2×108個(gè)/mL；離心，收集各菌沉淀及上清液，將上清液用微孔濾膜過(guò)濾除菌后，-20 ℃保存?zhèn)溆?；菌體沉淀用無(wú)菌水懸浮，調(diào)整其密度使其與各菌液濃度一致，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 釘螺毒性試驗(yàn)

1.6.1 滅螺考核方法 將細(xì)菌發(fā)酵液(bacteria fermented liquor,BFL)、菌體懸浮液(bacteria suspension,BS)及發(fā)酵上清液(fermented supernatant,FS)分別用去氯水稀釋20倍后配制成5%(v/v)的溶液。室溫下，挑選野外采集的螺齡相仿、活力強(qiáng)的成螺，每容器投放3袋釘螺(尼龍網(wǎng)袋)，20只/袋，共60只釘螺，分別置于各溶液中浸泡24 h、48 h和72 h后，取出釘螺，用水逸法和敲擊法測(cè)定釘螺死活，同時(shí)設(shè)去氯水和培養(yǎng)液為對(duì)照組，記錄各組釘螺的死亡數(shù)和死亡率，每組重復(fù)3次，取其平均值。

1.6.2 殺螺效果指標(biāo) 感染48 h后，釘螺死亡率超過(guò)50%以上的為有效菌株，超過(guò)90%以上為強(qiáng)毒株。

1.6.3 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)觀察數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各試驗(yàn)組間滅螺效果比較采用χ2檢驗(yàn)法，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 滅螺效果觀察

2.1.1 滅螺效果整體觀察 從釘螺孳生土壤中共分離得到細(xì)菌96株，經(jīng)過(guò)初篩，篩選出滅螺毒性較高的菌株4株，將其編號(hào)為B8、B27、B36、B59。將4株細(xì)菌的發(fā)酵液、發(fā)酵上清液和菌體懸液分別浸泡釘螺24 h、48 h、72 h。滅螺結(jié)果顯示：各菌株的發(fā)酵液、發(fā)酵上清液和菌體懸液對(duì)釘螺均表現(xiàn)出不同的毒力，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，釘螺的死亡率明顯增加的趨勢(shì)。從整體效果觀察得出：發(fā)酵上清液滅螺效果最明顯(χ2=21.286，P=0.002)，48 h對(duì)釘螺的死亡率高于65%，72 h釘螺的死亡率高于90%；其次為細(xì)菌發(fā)酵液(χ2=17.298，P=0.008)，48 h釘螺的死亡率達(dá)50%以上，72 h釘螺的死亡率高于95%；菌體懸液的殺螺效果最差(χ2=7.579，P=0.271)，48 h釘螺的死亡率低于60%，72 h對(duì)釘螺的死亡率低于80%。(表1)

2.1.2 各菌株滅螺效果觀察 細(xì)菌發(fā)酵液組各組間比較結(jié)果：B8菌株與其它菌株之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，B27、B36、B59菌株之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；發(fā)酵上清液組各菌株各組間比較結(jié)果：B8-B59組與B36-B59組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明B59菌株滅螺效果優(yōu)于B8、B36菌株，其它各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；菌體懸液組各菌株之間比較結(jié)果：B8-B59組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其它各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由以上結(jié)果綜合比較得出：B59菌株的滅螺效果優(yōu)于其它3菌株，B27、B36菌株其次，B8菌株最弱。(表2)

2.1.3 B59菌株各試驗(yàn)組間滅螺效果比較 B59菌株各試驗(yàn)組組間釘螺的死亡率比較未顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P>0.05)，相對(duì)而言發(fā)酵上清液效果較好(χ2=5.439，P=0.069) (表3)

3 討 論

從釘螺孳生土壤中分離出4株滅螺效果較好的菌株，4株菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)釘螺的毒性試驗(yàn)表明，發(fā)酵上清液的毒力最強(qiáng)，48 h對(duì)釘螺的死亡率高達(dá)65%以上，72 h釘螺的死亡率高達(dá)90%以上，說(shuō)明殺釘螺的有效成分主要在細(xì)菌發(fā)酵上清液中，這與郭青云等[13]的研究結(jié)果是一致的；細(xì)菌發(fā)酵液的滅螺效果次之，48 h釘螺的死亡率達(dá)50%以上，但72 h釘螺的死亡率高達(dá)95%以上，細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)釘螺的毒力作用可能是由于細(xì)菌產(chǎn)生的毒素或其它代謝產(chǎn)物所致，郭丹釗等[14]研究報(bào)道SL-30菌株對(duì)釘螺的致死性可能是由于影響釘螺的糖代謝或蛋白合成所致；菌體懸液滅螺效果最弱，48 h釘螺死亡率不超50%；研究還發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液對(duì)照組對(duì)釘螺的毒力也比較強(qiáng)，雖然48 h釘螺死亡率不超35%，但72 h后釘螺死亡率高達(dá)90%以上，這與郭青云[13]、張桂敏[15]等研究報(bào)道不同，其原因可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中含有Cl-對(duì)釘螺有毒害作用,亦或發(fā)酵液的鹽濃度、滲透壓不適合釘螺生存所致，具體原因有待進(jìn)一步深入分析。

表1 分離菌株各成分浸泡不同時(shí)間滅螺效果

表2 菌株不同成分浸泡不同時(shí)間滅螺效果組間比較

表3 B59菌株各試驗(yàn)組間滅螺效果比較

結(jié)果表明B59菌株具有較強(qiáng)的滅螺效果。姚超素等[16]道，細(xì)菌“673”，0.9億個(gè)/mL活菌室內(nèi)浸泡48 h，感染釘螺2～4 d死亡率可達(dá)100%，而B(niǎo)59菌株感染劑量為107個(gè)/mL,48 h釘螺的死亡率可達(dá)73.3%，其感染劑量、時(shí)間及效果均優(yōu)于細(xì)菌“673”；肖瑞芬等[11]報(bào)道，自養(yǎng)黃色桿菌感染劑量3×106個(gè)/mL，48 h釘螺死亡率57.5%，B59菌株與其相比各有所長(zhǎng)。 有關(guān)B59菌株的鑒定、分類(lèi)及其有效代謝產(chǎn)物的分析、鑒定，有待進(jìn)一步研究。

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Screening and molluscicidal activity of microorganism againstOncomelaniahupensis

CUI Guo-yan1,2,WANG Shi-ping1,CHENG Hong-bing2,HE Xin1,LYUQIU Si-jia1,HUANG Cheng-ming1

(1.DepartmentofParasitology,XiangyaMedicalSchoolCentralSouthUniversity,Changsha410078,China;2.DepartmentofMicrobiology,ChangzhiMedicalCollege,Changzhi046000,China)

We screened the efficient, durable, safe and inexpensive molluscicidal microorganisms againstOncomelaniahupensisand observed the mollusicicidal effects of microorganism in this study. Bacteria with highly toxic toOncomelaniahupensiswere screened from the soil samples of habitat. The bacteria were prepared into bacterial fermented liquor, fermented supernatant and bacteria suspension respectively. The mollusicicidal effects were tested in the experiment base of prevention and control schistosomiasis. The four strains (B8, B27, B36, and B59) which were highly toxic toOncomelaniahupensiswere isolated by preliminary screening. Results of mollusicicidal effects showed that 4 strains of bacteria different components including the fermented liquor, fermented supernatant and bacteria suspension were in different levels of toxicity to snails. According to the comprehensive comparison, B59 strain had the excellent molluscicidal activity. The second ones were B27 and B36 strain. The last one was B8 strain. By the statistical analysis, mollusicicidal effects of the four strains were significant differences (χ2= 21.286,P=0.002). mollusicicidal effect of the four strains were also significantly different (χ2=17.298,P=0.008). mollusicicidal effects of the four strains were not significantly different in the bacteria suspension (χ2=7.579,P=0.271). The fermented supernatant of B59 strain was significantly superior to other strains by mollusicicidal effect analysis.

Schistosomiasis;Oncomelaniahupensis; microorganism; mollusicicidal effect; death rate

Wang Shi-ping, Email: wsp4373383@126.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81271862)和國(guó)家科技支撐計(jì)劃(No.2009BAI78B05)聯(lián)合資助

汪世平， Email: wsp4373383@126.com

1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)教研室，長(zhǎng)沙 410078； 2.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室,長(zhǎng)治 046000

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.003

R383.2

A

1002-2694(2015)02-0109-04

2014-10-15；

2014-11-27

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81271862) and the National Technological Support Projects of China (No. 2009BAI78B05)