佛手的抗菌抗氧化研究

付 麗，盧文青，周曉敏，李澤謙，謝志成

(廣東省廣州市荔灣區(qū)疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科 510176)

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·論 著·

佛手的抗菌抗氧化研究

付 麗，盧文青，周曉敏，李澤謙，謝志成

(廣東省廣州市荔灣區(qū)疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科 510176)

目的 了解佛手對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等8種常見(jiàn)致病菌的抗菌作用及其抗氧化性能。方法 分別用80%的甲醇水提取新鮮成熟的佛手及其烘干制品的酚類物質(zhì)。采用微量稀釋法，測(cè)定其提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、福氏志賀氏菌、銅綠假單胞菌、蠟樣芽孢桿菌、表皮葡萄球菌及白色念珠菌8種常見(jiàn)致病菌的最小抑菌濃度及最小殺菌濃度，并對(duì)其抗菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)；采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其氧化還原能力及清除自由基能力，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 佛手提取液對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的抗菌作用強(qiáng)于革蘭陰性菌。烘干后的佛手提取液的抗氧化作用強(qiáng)于新鮮佛手。結(jié)論 佛手對(duì)常見(jiàn)的致病菌有較強(qiáng)的抗菌作用，可以開(kāi)發(fā)其成為新型天然抑菌劑。

佛手； 抗菌活性； 抗氧化活性； 最小殺菌濃度

佛手為熱帶、亞熱帶植物，是蕓香科常綠小喬木或灌木。又名九爪木、五指橘、佛手柑，在我國(guó)主要產(chǎn)于閩粵、川、江浙等地區(qū)[1-2]。佛手可以入藥，制作涼茶飲料，有理氣化痰、止嘔消脹、舒肝健脾、緩解哮喘等多種作用。但對(duì)其機(jī)理的研究目前尚缺乏。本研究選取廣州市場(chǎng)上銷售的佛手，研究其酚類提取液對(duì)常見(jiàn)8種致病菌的抗菌作用，并研究新鮮和烘干制品佛手的抗氧化作用。

1 材料與方法

1．1 樣品前處理、實(shí)驗(yàn)菌種與試劑

1．1．1 樣品前處理 抗菌研究的前處理：將新鮮成熟的佛手用自來(lái)水反復(fù)沖洗干凈后用去離子水洗凈，切片置60 ℃烘箱48 h，烘干樣品并粉碎。稱取50.0 g烘干粉碎的佛手，加入250 mL去離子水，超聲萃取60 min。濾去殘?jiān)?，將剩余液體加熱濃縮20 mL(制成濃度為2.5 g/mL的原液)，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，待測(cè)抗菌指標(biāo)?？寡趸芯康那疤幚恚喝∵m量新鮮成熟的佛手勻漿，分別稱取佛手的勻漿液和烘干物1.0 g左右，加入9.00 mL 80%的甲醇水，充分振搖，微波超聲萃取30 min，3 500 r/min下離心30 min，取上清液待測(cè)抗氧化指標(biāo)。

1．1．2 實(shí)驗(yàn)菌種 實(shí)驗(yàn)選取了金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、大腸埃希菌ATCC25922、鼠傷寒沙門氏菌CMCC(B)50115、福氏志賀氏菌CMCC(B)51572、銅綠假單胞菌ATCC27853、蠟樣芽孢桿菌CMCC(B)63301、表皮葡萄球菌CMCC(B)26069及白色念珠菌CMCC(F)98001共8種常見(jiàn)的致病菌。所有的標(biāo)準(zhǔn)菌株全部購(gòu)于廣東環(huán)凱生物科技有限公司。將菌株從長(zhǎng)期貯存的CRYOBANK菌種保存管中取出，接營(yíng)養(yǎng)肉湯復(fù)活，并分別培養(yǎng)做各項(xiàng)生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1．1．3 試劑 三吡啶三吖嗪TPTZ(2,4,6-Tri(2-pyridyl)-s-triazine/tripyridyltriazine)、VitE衍生物Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid)、ABTS (2,2-azino-di-(3-ethylbenzothialozine-sulphonic acid))等化學(xué)試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma-aldrich公司。無(wú)水醋酸鈉、三氯化鐵、硫酸亞鐵、過(guò)硫酸鉀、碳酸鈉等化學(xué)試劑均為分析純，由天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。甲醇、鹽酸、無(wú)水醋酸等均為分析純，由成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。

1．1．4 儀器 分析天平、超聲清洗器、培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)等。

1．2 測(cè)定原理與方法

1．2．1 抗菌研究

1．2．1．1 實(shí)驗(yàn)菌種配制 用麥?zhǔn)媳葷醿x將實(shí)驗(yàn)所用菌液配制為0.5麥?zhǔn)蠞舛?約為1.5×108/mL)的菌液并用生理鹽水按1∶10的比例稀釋2次，菌液最終濃度約為1.5×106/mL。

1．2．1．2 最小抑菌濃度(MIC)檢測(cè) 用去離子水將實(shí)驗(yàn)樣品依次等倍稀釋。分別取70 μL不同濃度的樣品加入裝有營(yíng)養(yǎng)肉湯(70 μL)和菌液(70 μL)的無(wú)菌96孔板中，每個(gè)濃度樣品重復(fù)3個(gè)平行樣。于微量振蕩器振蕩混勻后放入酶標(biāo)儀(630 nm)讀取培養(yǎng)前吸光度。再置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h再次測(cè)定其吸光度。用肉眼從最小濃度開(kāi)始觀察，第1個(gè)出現(xiàn)未渾濁的孔所對(duì)應(yīng)的樣品濃度即為樣品的MIC[3-4]。

1．2．1．3 最小殺菌濃度(MBC)檢測(cè) 從所有未出現(xiàn)渾濁的微孔中，取出200 μL液體接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中。置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長(zhǎng)狀況。24 h培養(yǎng)后沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿所對(duì)應(yīng)的樣品最小濃度即為樣品的MBC[3-4]。

1．2．2 抗氧化研究

1．2．2．1 氧化還原能力——FRAP法[5-7]FRAP法是由Benzie和Strain建立的，其原理為Fe3+-TPTZ可被樣品中還原物質(zhì)還原為二價(jià)鐵形式，呈現(xiàn)出藍(lán)色，并于593 nm處具有最大光吸收，根據(jù)吸光度大小計(jì)算樣品抗氧化活性的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)步驟如下：以 FeSO4溶液作為參考標(biāo)準(zhǔn)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。取100 μL樣本稀釋液加入到3.00 mL FRAP反應(yīng)液中(由300 mmol/L的醋酸鈉、10 mmol/L的TPTZ、20 mmol/L的三氯化鐵按照10∶1∶1的體積比組成)，混勻后37 ℃反應(yīng)4 min，用紫外分光光度計(jì)在593 nm下測(cè)定混合物的吸光度，根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)FeSO4的濃度。每份樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1．2．2．2 清除自由基能力——TEAC法[8]TEAC法的原理是ABTS在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS+，在抗氧化物存在時(shí)ABTS+的產(chǎn)生會(huì)被抑制，在734 nm或405 nm下測(cè)定ABTS+的吸光度即可測(cè)定并計(jì)算出樣品的總抗氧化能力。Trolox是一種VitE的類似物，具有和VitE相近的抗氧化能力，用作其他抗氧化物總抗氧化能力的參考。實(shí)驗(yàn)步驟如下：以Trolox溶液作為參考標(biāo)準(zhǔn)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。取100 μL被稀釋了的樣品與3.80 mL被稀釋了的ABTS自由基溶液(7 mmol/L ABTS與2.45 mmol/L 的過(guò)硫酸鉀等量混合避光放置16 h后將ABTS稀釋到在734 nm處的吸光度為0.7±0.05)充分混合，并在室溫下反應(yīng)6 min，用紫外分光光度計(jì)在734 nm下測(cè)定混合物的吸光度，根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)Trolox的濃度。每份樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用EXCEL錄入，使用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2．1 抗菌研究結(jié)果 佛手提取液對(duì)實(shí)驗(yàn)所選的8種常見(jiàn)致病菌都有一定的抗菌作用，尤其對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌作用明顯強(qiáng)于其他菌種，其MIC可達(dá)到312.5 mg/mL。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，佛手提取液對(duì)所選革蘭陽(yáng)性菌的MIC在312.5～625 mg/mL，對(duì)革蘭陰性菌的MIC在625～1 250 mg/mL；佛手提取液對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的MBC在312.5～1 250 mg/mL；對(duì)革蘭陰性菌的MBC均為1 250 mg/mL。綜合MIC、MBC研究結(jié)果，當(dāng)MBC/MIC≤4時(shí)，表明研究樣品對(duì)該菌種有殺菌作用；當(dāng)MBC/MIC>4，表明研究樣品對(duì)該菌種有抑菌作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，佛手對(duì)實(shí)驗(yàn)的8種常見(jiàn)致病菌均有殺菌作用。見(jiàn)表1。

表1 佛手抗菌檢測(cè)MIC、MBC結(jié)果(mg/mL)

2．2 抗氧化研究結(jié)果 FRAP檢測(cè)中FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制的回歸方程：Y=0.000 72X+0.051 70，R2=0.999 99，TEAC檢測(cè)中ABTS標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制的回歸方程：Y=0.000 93X-0.003 67，R2=0.999 93。本研究發(fā)現(xiàn)，烘干佛手的抗氧化作用[FRAP：(15.60±0.54)μmol Fe2+/g，TEAC：(0.83±0.39)mol Trolox /g]明顯強(qiáng)于新鮮佛手[FRAP：(4.82±0.11)μmol Fe2+/g，TEAC：(3.11±0.31)μmol Trolox /g]。烘干樣品的抗氧化研究結(jié)果大約為新鮮樣品結(jié)果的3倍左右。另外，本實(shí)驗(yàn)以維生素C作參照[FRAP：(12.66±0.13)mmol Fe2+/g，TEAC：(5.42±0.05)mmol Trolox/g]，發(fā)現(xiàn)烘干的佛手(1 g/10 mL)的抗氧化活性高于100 μg/mL的VC的抗氧化活性，而新鮮的佛手(1 g/10 mL)的抗氧化活性明顯低于100 μg/mL的VC的抗氧化活性。

3 討 論

總體來(lái)說(shuō)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，佛手對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的抗菌作用要強(qiáng)于革蘭陰性菌。此研究結(jié)果與其他抗菌研究結(jié)果一致[9-12]。其原因可能是因?yàn)楦锾m陰性菌與革蘭陽(yáng)性菌擁有不同的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，此外革蘭陰性菌還具有獨(dú)特的壁膜間隙[13]，這些不同使得革蘭陰性菌在抵擋細(xì)菌入侵方面更勝一籌?？寡趸矫?，作者曾檢測(cè)過(guò)廣州市場(chǎng)上銷售的62種水果的抗氧化活性及其總酚含量[11]。與之相比，新鮮佛手抗氧化的結(jié)果低于作者先前研究的平均結(jié)果，其FRAP明顯低于金絲小棗、紅石榴、番石榴、番荔枝、大紅柿，但高于山竹、蜜梨、黃瓤西瓜、火龍果等，基本與哈密瓜、水仙芒、國(guó)產(chǎn)青提FRAP水平相當(dāng)。其TEAC明顯低于青橄欖、紅石榴、番荔枝、番石榴、大紅柿，但高于蜜梨、黃瓤西瓜、牛油果、紅提、有機(jī)藍(lán)莓和國(guó)產(chǎn)青提，基本與西柚、柚子、木瓜TEAC水平相當(dāng)。

近年來(lái)，由于食品添加劑致病和致癌風(fēng)險(xiǎn)的逐漸增大，人工合成抑菌劑及防腐劑越來(lái)越受到普通老百姓的質(zhì)疑。從自然界的植物中尋求天然產(chǎn)物來(lái)替代人工合成物質(zhì)成為現(xiàn)代工業(yè)研究的一個(gè)新領(lǐng)域。對(duì)傳統(tǒng)植物應(yīng)用現(xiàn)代科學(xué)方法進(jìn)行研究，揭示其傳統(tǒng)保健作用的科學(xué)基礎(chǔ)，是目前這一領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，也是未來(lái)研究的重要方向。國(guó)內(nèi)的植物抗菌抗氧化研究主要是針對(duì)大量中草藥、香料抗菌抗氧化能力的篩選上，而國(guó)外的植物抗菌抗氧化研究則主要是針對(duì)單個(gè)植物品種抗菌抗氧化能力的檢測(cè)和活性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究。除了中草藥和香料，許多水果蔬菜也被研究發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的抗菌、抗氧化、抗癌的成分。金絲小棗、石榴、番石榴、番荔枝、柿子等水果被研究發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的抗氧化作用[11]。而牛油果、葡萄籽、石榴皮也被發(fā)現(xiàn)具有抗菌的作用[14-16]。

中醫(yī)認(rèn)為佛手具有理氣化痰、止嘔消脹、舒肝健脾、和胃等多種藥用功能，對(duì)氣管炎、哮喘病有明顯的緩解作用，同時(shí)對(duì)一般的消化不良、胸腹脹悶也有明顯療效。這些作用和本研究中發(fā)現(xiàn)的佛手較強(qiáng)的抗菌作用關(guān)系有待進(jìn)一步明確。目前對(duì)佛手的其他微生物和理化研究比較少。郭衛(wèi)東等[1]研究發(fā)現(xiàn)佛手揮發(fā)油對(duì)酵母菌、大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用，并且對(duì)枯草桿菌的抑菌效果最強(qiáng)。水果蔬菜中含有大量的酚類和黃酮類物質(zhì)，作者先前的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)水果中的酚類物質(zhì)具有抗氧化活性，許多研究也發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)具有抗菌抗氧化的作用[14-20]。通過(guò)對(duì)佛手提取物的研究，發(fā)現(xiàn)雖然佛手的抗氧化能力一般，但其抗菌活性較強(qiáng)。有研究發(fā)現(xiàn)佛手含有柚苷、橙皮素、異槲皮苷、香葉木素、柚皮蕓香甙等酚類及黃酮類物質(zhì)。佛手的抗菌活性同時(shí)可能與其含有的酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)等可能密切相關(guān)。由于抗菌藥物的濫用，多藥耐藥菌的出現(xiàn)越來(lái)越引起醫(yī)療界的關(guān)注。其中金黃色葡萄球菌就是全球公認(rèn)的一種多藥耐藥菌，而在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)佛手對(duì)金黃色葡萄球菌具有非常明顯的抑制作用，或許佛手中的某些生物成分可以用來(lái)制成未來(lái)臨床應(yīng)用的藥物。雖然許多對(duì)水果蔬菜的研究已證明其含有的許多天然成分可以促進(jìn)人類健康、降低常見(jiàn)疾病的風(fēng)險(xiǎn)，但是公眾似乎并沒(méi)有意識(shí)到這些天然成分可以被加以利用，無(wú)論是藥品制造業(yè)，還是食品加工業(yè)，植物提取抗菌抗氧化成分完全可以替代現(xiàn)在常用的人工化學(xué)制品。

本研究發(fā)現(xiàn)，佛手對(duì)常見(jiàn)的致病菌有較強(qiáng)的抗菌作用，其酚類具有一定的抗氧化作用。這可能構(gòu)成佛手常見(jiàn)的藥理和食療作用機(jī)理。據(jù)此可以考慮開(kāi)發(fā)佛手成為新型天然抑菌劑。

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Study on antibacterial and antioxidant activities of extraction from C.m.var.sarcodactylis*

FULi,LUWen-qing,ZHOUXiao-min,LIZe-qian,XIEzhi-cheng

(LiwanDistrictCenterforDiseaseControlandPrevention,Guangzhou,Guangdong510176,China)

Objective To understand the antibacterial activity of extract of C.m.var.sarcodactylis.against 8 kinds of common pathogenic bacteria and its antioxidant activity.Methods The phenolic substances from fresh and dried C.m.var.sarcodactylis.were extracted by 80% methanol.The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of the extracting solution against 8 kinds of target pathogens involving Staphylococcus aureus,Escherichia coli,Salmonella typhimurium,Shigella flexneri,Bacillus cereus,Pseudomonas aeruginosa,Staphylococcus epidermidis and Monilia albican were determined and its antibacterial activities were evaluated by using microdilution broth method;FRAP and TEAC were also determined and its antioxidant activities was evaluated by using ultraviolet and visible spectrophotometer.Results The antibacterial effect of the extracting solution from C.m.var.sarcodactylis.against Gram-positive bacteria was stronger than that against Gram-negative bacteria.The antioxidant effect of the extracting solution from dried C.m.var.sarcodactylis.was stronger than that of the fresh.Conclusion C.m.var.sarcodactylis has strong antibacterial effect on common pathogenic bacteria and can be developed to become a new type of natural bacteriostatic agent.

C.m.var.sarcodactylis; antibacterial activity; antioxidant activity; minimum bactericidal concentration

廣東省廣州市荔灣區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(20141215057)。

付麗，女，碩士，主管技師，研究方向?yàn)槲⑸餀z驗(yàn)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.008

A

1672-9455(2015)13-1837-03

2015-01-25

2015-03-18)